[发明专利]参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用

说明书

本发明提供参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶及其编码基因与应用，CitOMT1的表达量在瓯柑(Citrus reticulata cv.Suavissima)果实发育过程中与多甲氧基黄酮的积累呈正相关；体外酶活试验表明所述的氧甲基转移酶可在催化黄酮类化合物特定位点甲基化中应用，尤其可以催化槲皮素生成槲皮素3’,4’二甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚，催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8‑二羟基黄酮生成7‑羟基‑8‑甲氧基黄酮。该酶活反应条件简单，且不需要额外添加金属离子，具有较高的应用价值和研究前景。

技术领域

本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶CitOMT1及其编码基因与应用。

背景技术

黄酮类化合物是植物中重要的次级代谢产物之一，在植物生长、发育及抗逆中发挥着重要的作用。已有文献表明氧甲基化的黄酮在抗氧化、抗肿瘤、降血糖以及预防心血管疾病等方面具有更强的活性，且其活性因甲氧基的位点和数量的变化有所不同。然而从植物中分离纯化或化学合成氧甲基化的黄酮工艺流程较为复杂。植物中存在氧甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)可以催化羟基化的黄酮类化合物在特定的位点甲基化，因此通过OMT酶法进行氧甲基化黄酮合成具有较高的应用前景。

柑橘中存在多种OMT参与了柑橘果皮中多甲氧基黄酮(PMFs)的合成。有文献报道柑橘中存在一种OMT，可以催化黄酮的3位、5位、6位、7位羟基，且能通过大肠杆菌细胞反应系统催化槲皮素的3,3’,5,7位点甲基化，最终生成槲皮素3,3’,5,7四甲酯。但是从植物中分离鉴定得到能够同时催化黄酮3’位、4’位、6位、8位的氧甲基转移酶还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶，该氧甲基转移酶来源于芸香科柑橘属植物瓯柑，属于Ⅱ类氧甲基转移酶，但不依赖于金属离子。且体外酶活试验表明CitOMT1能够催化槲皮素终最生成槲皮素3’,4’甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚；催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8-二羟基黄酮生成7-羟基-8-甲氧基黄酮。其酶活反应条件简单，且不需要额外添加金属离子，易于操作。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的一个参与柑橘果皮黄酮合成的氧甲基转移酶CitOMT1，其氨基酸序列为以下之一：

(1)SEQ:No.1所示的氨基酸序列；

(2)或将SEQ:No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加且功能相同的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供所述氧甲基转移酶CitOMT1的编码基因，其核苷酸序列为以下之一：

(1)SEQ:No.2所示的核苷酸序列；

(2)或与SEQ:No.2所示的核苷酸序列具有90％及以上同源性且编码具有相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明提供用于扩增上述编码基因的引物对，其核苷酸序列分别为SEQ:No.3和SEQ:No.4所示。

本发明提供上述编码基因的表达载体，所述表达载体为插入上述编码基因的表达载体pET32a。

本发明提供含有上述表达载体的重组细胞或转化体，所述重组细胞为BL21(DE3)pLysS(Promega)。

本发明的第三个目的是提供所述的氧甲基转移酶在体外表达实现催化黄酮类化合物在特定的位点甲基化中的应用，具体为提供所述氧甲基转移酶CitOMT1在催化槲皮素最终生成槲皮素3’,4’二甲酯；催化木犀草素生成金圣草素；催化圣草酚生成橙皮素、高圣草酚；催化黄芩素生成千层纸素A；催化7,8-二羟基黄酮生成7-羟基-8-甲氧基黄酮中的应用。

本发明的有益效果：