[发明专利]一种分离细胞的方法

权利要求书

1.一种分离细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将Ficoll和液体石蜡加入容器中，离心后滴加血液样品，使得血液与Ficoll形成分层液体；

(2)将步骤(1)分层后的液体进行离心后，在Ficoll上液面形成白色层；

(3)将步骤(2)得到的白色层取出，离心漂洗得到单个核细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述血液样品包括外周血、骨髓穿刺、脐带血或白膜中的任意一种或至少两种的组合，优选为脐带血；

优选地，步骤(1)所述Ficoll与液体石蜡的体积比为1:(0.5-2.5)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的转速为800-1200g；

优选地，步骤(2)所述离心的时间为10-20min。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述离心的转速为500-1500g；

优选地，步骤(3)所述离心的时间为5-15min；

优选地，步骤(3)所述漂洗的稀释液包括1640培养基、DMEM培养基、IMDM培养基、PBS或2mM EDTA中的任意一种或至少两种的组合，优选为PBS和2mM EDTA的组合；

优选地，步骤(3)所述漂洗的次数为2-5次。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将步骤(3)得到的单个核细胞进行磁珠分选的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述磁珠分选的方法包括如下步骤：

(1’)将步骤(3)得到的单个核细胞加入PBS悬浮后过细胞筛，加入阻断剂和CD34⁺磁珠进行孵育；

(2’)将步骤(1’)孵育后的细胞液过细胞筛后加到MS柱中进行负压抽吸过柱，然后加入PBS进行负压抽吸过柱漂洗；

(3’)向步骤(2’)的MS柱中加入StemSpan培养基，移离磁铁架，负压抽吸，洗脱得到CD34⁺细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述负压抽吸为采用注射器从柱子下端口对接，进行负压抽吸过柱。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述细胞筛为30-40μM细胞筛；

优选地，步骤(1’)所述阻断剂与CD34⁺磁珠的比例为1:1。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1’)所述孵育的时间为30-60min；

优选地，步骤(2’)所述PBS的漂洗次数为2-5次。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将体积比为1:(0.5-2.5)的Ficoll和液体石蜡加入容器中，400-2000g离心10-120s后滴加血液样品，使得血液与Ficoll形成分层液体；

(2)将步骤(1)分层后的液体进行慢升慢降800-1200g离心10-20min后，在Ficoll上液面形成白色层；

(3)将步骤(2)得到的白色层取出，500-1500g离心5-15min，PBS+2mM EDTA稀释液漂洗2-5次得到单个核细胞；

(4)将步骤(3)得到的单个核细胞加入PBS悬浮后过30-40μM细胞筛，加入体积比为1:1的阻断剂和CD34⁺磁珠进行孵育30-60min；

(5)将步骤(4)孵育后的细胞液过细胞筛后加到MS柱中进行负压抽吸过柱，然后加入PBS进行负压抽吸过柱漂洗2-5次；

(6)向步骤(5)的MS柱中加入StemSpan培养基，移离磁铁架，负压抽吸，洗脱得到CD34⁺细胞。