[发明专利]一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法

说明书

本发明公开了一种胚胎培养液，其中含有200～400nM的如结构式(1)所示的化合物。该胚胎培养液效果明显，其克隆胚胎的囊胚率极显著提高，从而提高了克隆技术的效率。本发明还公开了一种体细胞克隆胚胎的处理方法，该体细胞克隆胚胎的处理方法操作简单，效果明显，可以极显著地提高包括但不局限于猪、牛、羊、鼠、人的克隆胚胎的体细胞核移植胚胎体外发育效率。

技术领域

本发明涉及细胞体外克隆技术领域，特别涉及一种胚胎培养液及一种体细胞克隆胚胎的处理方法。

背景技术

尽管已有很多动物通过体细胞克隆技术获得成年个体，但该技术效率低下仍是限制应用的主要原因。目前的研究表明，效率低主要是有克隆胚胎重编程异常造成的，如组蛋白低乙酰化和DNA高甲基化。克隆胚胎供体细胞核的大部分重编程发生在胚胎基因组激活前的早期胚胎中，组蛋白乙酰化是一种表观遗传修饰，是胚胎基因激活的关键因素之一。组蛋白乙酰转移酶作用于组蛋白使之发生乙酰化后，会导致染色质构象松散，允许转录因子的接近，从而使转录发生，激活基因重编程。而组蛋白去乙酰化酶的作用则相反，能够使组蛋白去乙酰化，抑制转录，降低胚胎重编程效率。使用完全分化的体细胞构建克隆胚胎，体细胞是定向转录的，其组蛋白去乙酰化酶含量较高，抑制了转录激活和基因表达，从而导致了克隆效率低下，因此采用抑制组蛋白去乙酰化酶是提高克隆效率的有效手段。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种胚胎培养液。本发明的另一个目的是提供一种体细胞克隆胚胎的处理方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种胚胎培养液，其中含有200～400nM的如结构式(1)所示的化合物：

该胚胎培养液效果明显，其克隆胚胎的囊胚率极显著提高，从而提高了克隆技术的效率。

在一些实施方式中，胚胎培养液中含有200nM、300nM或者400nM的上述化合物。

优选地，胚胎培养液得组成份及其含量分别为:

其中，LAQ824为上述化合物。

根据本发明的一个方面，提供了一种体细胞克隆胚胎的处理方法，包括以下步骤：

S1、激活核移植重构胚；

S2、转入上述的胚胎培养液中培养24h；

S3、更换为普通胚胎培养液，继续培养至168h。

克隆胚胎可以包括所有哺乳动物，包括但不局限于猪、牛、羊、鼠、人的克隆胚胎。

在一些实施方式中，S1步骤包括：将卵母细胞使用显微操作仪去除极体及附近约15％的胞质，然后使用荧光染料染色2min，并在荧光显微镜下观察，废弃未完全去掉核的卵母细胞，在去除完全的卵母细胞的卵周隙注入一个供体细胞完成重构胚胎，重构胚胎放入电融合液后，使用85v/mm、60μs、2次脉冲将重构胚胎融合，然后将重构胚胎转移到胚胎培养液中孵育1h，挑选融合的重构胚胎使用80v/mm、80μs、2次脉冲直流电进行激活。

在一些实施方式中，卵母细胞通过以下方式采集：

从屠宰场母猪获取的卵巢，放入37℃生理盐水内运回实验室，使用添加抗生素的生理盐水冲洗3遍后，用配有18G针头的10mL注射器抽取2-6mm的卵泡，在体视显微镜下用自制捡卵针捡取卵丘-卵母细胞复合体，用洗卵液洗3遍后，再用成熟培养液洗2遍，然后放入已在CO₂培养箱内平衡4h以上的成熟培养液中，在39℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中成熟培养44h；将成熟培养后的卵丘-卵母细胞复合体与0.1％透明质酸酶混合，用移液枪反复吹打除去卵丘细胞，去除卵丘细胞的卵母细胞挑选出卵周隙明显且无杂质、胞质均匀、明显排出第一极体的卵母细胞进行克隆胚胎的构建。