[发明专利]一种鱼类雄性不育模型的建立方法

权利要求书

1.一种鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术对减数分裂相关基因spo11进行敲除，杂合体可育，杂合体自交得到的纯合体群体中的雄性个体不育，从而建立鱼类雄性不育模型。

2.根据权利要求1所述的鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，建立时，利用PCR技术区分纯合雄性和杂合雄性。

3.根据权利要求2所述的鱼类雄性不育模型的建立方法，其特征在于，上述通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼spo11基因的步骤如下：

（1）通过ensembl在线数据库查找斑马鱼spo11基因组序列no:ENSDART00000005373.9,在该基因第一个外显子上设计敲除靶位点，靶位点序列为序列1，即：TGGAAACGGTCGACAGATGCCAGG；

（2）按常规方法检测靶位点是否存在单核苷酸多态性；

（3）gRNA的获得：

以gRNA-plasmid为模板，以gRNA-F/gRNA-R为引物，gRNA-F的序列如序列2：TAATACGACTCACTATAGGGTGGAAACGGTCGACAGATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAAG；gRNA-R的核苷酸序列如序列3：AGCACCGACTCGGTGCCACT,利用KOD Plus（TAKARA）高保真酶进行PCR扩增，扩增产物割胶回收，回收产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，挑取5个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序进行序列验证，序列正确克隆扩大培养后提取质粒DNA作为下一步转录gRNA的模板；再利用MEGAscript® T7 Transcription Kit(Invitrogen^TM)将构建好的含有spo11靶序列的质粒体外逆转录20ｕl反应体系如下：

10x Reaction Buffer 2ｕl；

Plasmid DNA 4ｕl (约1ｕg）；

T7 Enzyme 2ｕl；

10mmol/L NTP 1ｕl；

DEPC water 11ｕl；

以上体系37℃反应一个小时后纯化备用；

（4）体外转录获得Cas9 mRNA ：

Cas9质粒来自Addgene^TM(#63154),使用MAXIscript®T7/T3 Transcription Kit(Invitrogen^TM),合成Cas9 mRNA，体系及反应条件同步骤3；

（5）Cas9 mRNA和gRNA显微共注射：首先配置显微注射体系如下：

Cas9 mRNA 300 ng/ｕl；

gRNA 30ng/ｕl；

Phenol-red 0.2ｕl；

DEPC Water up to 2ｕl；

将上述溶液配好混匀后，显微注射单细胞时期的斑马鱼受精卵中，养殖24小时后检测spo11基因的突变效率；

（6）spo11 F1代杂合突变个体的筛选及突变类型确定：

经过步骤（5）显微注射后斑马鱼受精卵，养殖3个月至性成熟后，与野生型个体杂交获得杂交F1代，F1代个体养殖2个月后，剪取部分尾鳍组织，提取基因组DNA，以F-spo11/R-spo11为引物，F-spo11：5’-ATGGCTTACCAGTTTACTG-3’; R-spo11: 5’-CGTAGCTCTTTCAGTAACTC-3’，利用KOD PLUS高保真酶(TAKARA)进行PCR扩增,PCR产物连接pMD18-T载体(TAKARA)后转化感受态大肠杆菌，分别挑取10个大肠杆菌单克隆扩大培养后提取质粒DNA，然后质粒DNA测序比对后筛选获得10条F1代个体突变效率和突变类型；

（7）spo11 F2代纯合突变个体的获得：

待spo11 F1代杂合突变个体性成熟后，选取突变类型一致的雌雄F1代个体各一条进行人工受精，获得spo11 F2代纯合突变个体；

（8）雄性不育雄性个体的选取：

spo11 F2代纯合突变群体中所有的雄性个体均为雄性不育个体，但是雌性个体中有卵子，且与野生雄鱼能够正常受精。