[发明专利]基于金属离子配位-分子印迹传感器的凝血酶检测方法

说明书

一种基于金属离子配位‑分子印迹传感器的凝血酶检测方法，所述方法将金属离子配位‑分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对凝血酶的高灵敏检测。所述金属离子配位‑分子印迹修饰电极制备方法包括：（1）氧化法制得氧化石墨烯；（2）得到还原石墨烯修饰玻碳电极；（3）得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极；（4）得到过渡金属‑凝血酶配合物；（5）制得金属离子配位‑分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。本发明提供了一种基于金属离子配位、分子印迹的电化学传感器灵敏地检测非电活性物质凝血酶的方法。

技术领域

本发明涉及一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器的凝血酶检测方法，属化学传感和电分析化学检测技术领域。

背景技术

凝血酶是一种广泛存在于哺乳动物血液凝固系统中的丝氨酸蛋白水解酶，可以催化体内纤维蛋白元转变成纤维蛋白，在创伤愈合、炎症、血液凝固等方面发挥着极其重要的作用，在临床上常用于毛细血管出血的局部止血和外科手术后组织的愈合，凝血酶的活性及浓度是衡量凝血机制是否健康的重要指标之一，在疾病早期诊断、疗效及愈后判断以及药物研究中具有十分重大的意义。

近年来，分子印迹电化学传感器虽然在生化分析、环境分析、食品和医药等领域的应用研究取得了较大的进展，但其选择性和灵敏度有待提高。过渡金属离子（如铜离子、锌离子、镍离子等）因为能与凝血酶一类的生物分子中的羰基和氨基等基团形成配位键稳定结构，对于生物体环境具有非常重大的意义。我们模拟这个生物结合过程制备金属离子-凝血酶配合物，利用金属离子配位作用和印迹膜特异性识别孔穴对目标分子的共识别能力，制备出结合能力强且选择性好的金属离子配位-印迹传感器。

为了提高分子印迹电化学传感器检测目标物的灵敏度，引入纳米材料如碳纳米管、金纳米粒子、石墨烯、纳米二氧化硅可有效增大分子印迹膜的比表面积而提高识别位点的数量，大大提高分子印迹电化学传感器的灵敏度。

发明内容

本发明的目的是，为了建立灵敏度高、选择性高和稳定性好的测定非电活性物质凝血酶的方法，提供一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器检测凝血酶方法。

实现本发明的技术方案是，本发明选择石墨烯和金纳米粒子为电极的增敏纳米材料，然后通过Au-S键，将半胱氨酸修饰到电极表面，接着通过金属离子与半胱氨酸上的氨基及羰基进行配位将金属离子-凝血酶络合物结合到修饰电极上。最后在有机染料（如硫堇、甲苯胺蓝、耐尔兰）溶液里进行高电位阳极化并循环伏安扫描聚合形成聚合物膜。通过化学溶液洗脱金属离子-凝血酶后，制备出金属离子配位-分子印迹传感器。配位印迹传感器在金属离子溶液中结合后，再置于凝血酶溶液中孵育，利用金属离子和印迹孔穴的共识别效应，能增强传感器的识别能力。利用电聚合引入的电化学探针的指示作用，建立灵敏度高、选择性高和稳定性好的测定非电活性物质凝血酶的无试剂型金属离子配位-分子印迹电化学传感方法。

一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器凝血酶检测方法，所述方法利用石墨烯/金纳米粒子复合纳米材料的增敏作用，金属离子配位作用和分子印迹形成的特异性孔穴的识别作用，分子印迹膜电化学探针的指示作用，将金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对凝血酶的高灵敏检测。

所述金属离子配位-分子印迹修饰电极制备方法的具体步骤如下：

（1）以石墨粉为原材料，通过Hummers 氧化法制得氧化石墨烯；

（2）将0.1～2.0mg/mL的氧化石墨烯2～20μL 滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干；然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8~ 0.4 V范围扫描5~40圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极；