[发明专利]一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法

说明书

本发明公开了一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，包括以下步骤：(1)通过固相合成非天然核酸待测序链，通过酶促连接的方法，将非天然核酸待测序链与DNA引导测序链连接起来，作为完整的待测序链；(2)制备具有单分子分辨能力的纳米传感孔道；(3)将待测序链和DNA引物混合，变性退火构建测序文库，然后与核酸聚合酶一起加入纳米孔的cis室，在电场力作用下核酸链通过纳米孔，读取核酸链过孔时产生的电信号，解析信号得到序列。相对于现有技术，本发明利用低成本的、高效的纳米孔测序方法，首次对连续非天然核酸链实现直接测序。

技术领域

本发明涉及一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，属于非天然核 酸测序技术领域。

背景技术

非天然核酸是指带有化学修饰的核酸类似物。FANA (2’-deoxy-2’-fluoroarabinonucleic acid，2’-氟代阿拉伯糖核酸)属于一类非天然核酸。与 天然核酸相比，FANA的抗酸降解以及抗酶降解能力都更为优越，因为和RNA具有强 亲和性，FANA被广泛应用于基因治疗领域。Masad J.Damha团队在2006年报道过反 义PS-FANA-DNA嵌合体在活细胞中有较好的抗降解性能。同年，他们比较了FANA修 饰的siRNA和天然siRNA分子的基因沉默效率，结果发现含有FANA的siRNA在触发 RNA干扰通路和序列特异性选择上都有更好的性能。另外，关于FANA酶，FANA纳 米结构和FANA适配体的报道也陆续出现。

传统的测序方法是用四种不同颜色的荧光基团标记不同的dNTPs(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)，在聚合酶催化发生引物延伸反应的同时，对不同颜色荧光信号的监测 来识别模板链的序列。目前应用于传统测序的聚合酶都无法识别FANA底物，所以无法 用传统方法对FANA进行直接测序。但是，可以通过间接手段对其测序，采用的方法为 先将FANA逆转录为DNA，再对DNA模板进行测序。其中最为关键的步骤是找到一种 对FANA底物具有活性的逆转录酶，在此方面，Philipp Holliger等人在2012年报道了 对FANA具有催化活性的非天然聚合酶D4K和RT521K，它们都是经过对天然聚合酶 Tgo的变体TgoT再次人工改造而得到的。这些聚合酶可以FANA为模板，接受dNTPs (deoxy-ribonucleoside triphosphates)底物，合成新的DNA链。然而，用这种间接的测序 方法有一个缺陷：因为酶催化的核酸聚合反应都存在一定的错误率，所以这种间接测序 方法的错误率不仅仅来源于DNA测序过程的错误，实际上还包括FANA逆转录为DNA 和DNA扩增两步反应错误率的叠加，这些因素都会对最终序列的确定造成干扰，因此， 本研究致力于寻找一种可以直接对FANA测序的技术。

纳米孔测序技术是一种可以在单分子水平上实现读取长链的测序方法，凭借成本低、 速度快、无需扩增、样品免标记等优点，成为最有潜力的“第三代测序技术”。经典的纳米孔测序装置为一个充满电解质溶液的腔体，一层绝缘薄膜将此腔体分为两个小室(cis室和trans室)，由于电泳力的作用，内含纳米尺度通道的某种膜蛋白会插入薄膜中，成 为两个小室离子通过的唯一通道。在测序条件下，DNA的磷酸糖环骨架带负电，在外 加电场的驱动下会通过纳米孔，此时通过纳米孔的离子数量会减少，相应的电流值会降 低。因为每种脱氧核苷酸的结构、电荷密度等不相同，所以它们引起的电流变化也不同， 通过对不同电信号的采集，可以获得DNA的序列信息。

但是，目前纳米孔测序技术多应用于天然核酸，尚没有一种可以对连续的非天然核 酸链测序的方法。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明提供了一种基于纳米孔对非天然核酸直接测 序的错位测序方法。

技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种基于纳米孔对非天然核酸直接测序的错位测序方法，其特征在于，包括以下步 骤：