[发明专利]一种双特异性抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种双特异性抗体的制备方法。本发明使用化学偶联的方法将两种不同的单克隆抗体CD3单抗、CLL1单抗通过化学偶联剂连接，最终合成双特异性抗体。该方法能有效地将CD3单抗与CLL1单抗制成CD3‑CLL1双抗，且合成率在95％以上。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，特别涉及CD3和CLL1单克隆抗体制备双特异性抗体的方法。

背景技术

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb)是新型的第二代抗体，拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞(一般为T细胞)相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤作用，是一种疗效远超普通抗体的新型靶向药物。BsAb以三功能抗体(Triomab)和双特异性T细胞衔接器(Bispeific T cell Engager，BiTE)为代表，与普通抗体相比具备更强特异性、引导T细胞杀伤肿瘤和降低脱靶毒性等显著优势，目前已经在肿瘤和炎症等相关疾病中应用。数据显示，BsAb杀伤肿瘤效果是普通抗体的100-1,000倍；用量最低可降为普通抗体的1/2,000，在药效和价格上比一般抗体更具竞争优势。

CD3分子表达在人全部T细胞上，是鉴定T细胞的重要标记。CD3分了是由γ、δ、ε和η等几种多肽链组成，并与T细胞识别抗原受体形成TCR/CD3复合物。其中TCR特异性识别抗原，而TCR与抗原结合后所产生的活化信号是由CD3分子传递到T细胞内部。

CLL1分子存在于外周血和骨髓的髓系细胞和大部分AML白血病细胞，同时也表达于AML大部分的CD34+CD38-干细胞上，而在正常人CD34+CD38-干细胞上不表达。白血病细胞表面抗原CLL-1的表达有助于区分髓系白血病和淋巴系列白血病。

双特异性抗体在自然状态下不存在，只能通过人工制备。常见方法有化学偶联法、双杂交瘤法、基因工程法等。但是双杂交瘤法会产生多种不需要的轻、重链配对产物导致双特异性抗体产量低且难以纯化；基因工程法得到的蛋白质则包含有一些外来的肽序列象链或者异性二聚作用形成的区域在临床应用时可能会引发免疫反应。而单克隆抗体技术已十分成熟，运用化学偶联法操作简单快捷，将两个完整IgG或两个抗体片段使用偶联剂合成，经纯化便可得到BsAb。

目前，国内有关抗CLL1与抗CD3双特异性抗体的制备研究尚无，为此我们提供了一种偶联剂将其二者连接，并对还原剂及偶联剂用量优化使其更具有效性。该方法可快速、大量制备双特异性抗体。

发明内容

本发明提供一种通过使用特定还原剂和偶联剂制备CD3-CLL1双特异性抗体的方法。

本发明的技术方案如下：

一种双特异性抗体制备方法，使用化学偶联的方法将两种单克隆抗体通过化学偶联剂连接合成双特异性抗体，所述单克隆抗体为CD3和CLL1。

本发明使用化学偶联的方法将两种单克隆抗体通过化学偶联剂连接合成双特异性抗体。该方法能有效地将CD3单抗与CLL1单抗制成CD3-CLL1双特异性抗体。

该方法首先将CD3单抗与CLL1单抗分别采用还原剂处理，然后将两者混合，并在同一个反应体系中通过偶联剂连接。

在优选实施例中，所采用的还原剂为所述还原剂为：三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP))。

在优选实施例中，所采用的偶联剂为二溴戊酮或二硫代酰基苯甲酸。

此外，本发明在还原剂和偶联剂的使用量上进行优化，得到较高纯度的双抗，其方法具有专属性。