[发明专利]一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法

权利要求书

1.一种鉴定激酶体外特异性磷酸化氨基酸位点的方法，包括以下步骤：

(1)令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应；

(2)在步骤(1)反应结束后将反应产物冰浴后进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段进行体外激酶反应的具体方法是：在EP管中加入激酶反应缓冲液、令待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段、激酶和ATP，然后将EP管置于预先加热至30℃的恒温水浴锅中水浴10～60min，优选为30min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，底物蛋白或肽段、激酶和ATP三种物质的加入量为：1～5μg底物蛋白或肽段、1～10ng激酶及20μM的ATP。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，所述的激酶是：细胞周期素依赖蛋白激酶5、蛋白激酶C或死亡相关蛋激酶1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的进行LC-MS/MS质谱检测与纯化和分析的具体方法是：首先，对激酶反应产物进行溶液内酶解；其次，选择毛细管高效液相色谱方法进行纯化然后，使用ESI质谱进行数据采集；最后进行质谱数据分析。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的对激酶反应产物进行溶液内酶解的具体方法是：吸取激酶反应产物10～100μg，优选范围20～40μg，进一步优选30μg，加入30μLSTD buffer，沸水浴5～10min，冷却至室温；加入200μL UA buffer，混匀，转入30kDa超滤管离心；加入200μL UA buffer，离心，弃滤液，加入100μL IAA，振荡1～3min，避光室温孵育30～60min，离心，加入100μL UA buffer，离心，重复2～4次；加入100μL25mM NH₄HCO₃，离心，重复2～4次；加入40μL 25mM NH₄HCO₃同时加入Trypsin，酶切过夜后离心；再加入40μL 25nMNH₄HCO₃，离心，酸化，得到酶解后的激酶反应产物。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的选择毛细管高效液相色谱方法进行纯化的具体方法是：A液为体积分数为0.1％甲酸的水溶液，B液为体积分数为0.1％甲酸的乙腈水溶液，乙腈水溶液中乙腈所占体积比为84％；色谱柱以体积分数为95％的A液平衡后，酶解后的激酶反应产物由自动进样器上样至Trap柱，色谱梯度：0-50min，B液线性梯度从4％到50％；50min-54min，B液线性梯度从50％到100％；54min-60min，B液维持在100％，得到经纯化的酶解后的激酶反应产物，即多肽和多肽碎片。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的使用ESI质谱进行数据采集的具体方法是：将经纯化的酶解后的激酶反应产物，即多肽和多肽碎片的质量电荷比按照每次全扫描后采集10个碎片图谱方法采集。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的进行质谱数据分析的具体方法是：质谱测试原始文件，即raw file，用Mascot2.2软件检索数据库，得到磷酸化氨基酸位点的鉴定结果，所述的数据库选择和设定为：Database选择待测磷酸化位点的底物蛋白或肽段氨基酸序列作为自建库，Taxonomy选择自建库，Enzyme选择Trypsin，Dynamicalmodifications选择Oxidation(M)；Phospho(STY)，Fixed modifications选择Carbamidomethyl(C)，Max Missed Cleavages选择2，Proteomics Tools选择3.1.6，设定Filter by score>＝20。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的LC-MS/MS质谱检测的具体条件是：检测仪器选择型号Q exactive(Thermo Finnigan,San Jose,CA)，进样方式选择Nanospray，毛细管温度200℃，检测方式为正离子，Trap柱选择Thermo scientific EASYcolumn上样柱(2cm×100μm 5μm-C18)，分析柱为Thermo scientific EASY column(75μm×100mm3μm-C18)。