[发明专利]用于检测酒精代谢基因多态性的引物组、试剂盒及其应用有效
| 申请号： | 201811274116.9 | 申请日： | 2018-10-29 |
| 公开（公告）号： | CN109355369B | 公开（公告）日： | 2022-04-19 |
| 发明（设计）人： | 曾钦龙;徐进美;谭洁亮;黎箐;唐佳 | 申请（专利权）人： | 江门市妇幼保健院 |
| 主分类号： | C12Q1/6883 | 分类号： | C12Q1/6883;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州三环专利商标代理有限公司 44202 | 代理人： | 宋静娜;郝传鑫 |
| 地址： | 529000 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 用于 检测 酒精 代谢 基因 多态性 引物 试剂盒 及其 应用 | ||
1.一种酒精代谢基因多态性检测试剂盒，其特征在于，包含以下引物：
(1)针对ADH1B基因rs1229984，c.143GA多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.1所示的上游引物、SEQ ID No.2所示的下游引物和SEQ ID No.3所示的探针；
(2)针对ALDH2基因rs671，c.1510GA多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.4所示的上游引物、SEQ ID No.5所示的下游引物和SEQ ID No.6所示的探针；
(3)针对GABRA2基因rs279845，c.255+4909AT多态性位点的检测引物：如SEQ ID No.7所示的上游引物、SEQ ID No.8所示的下游引物和SEQ ID No.9所示的探针；
所述SEQ ID No.3所示的探针、SEQ ID No.6所示的探针和SEQ ID No.9所示的探针的5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有非荧光淬灭基团；
所述SEQ ID No.3所示的探针5’端连接的荧光报告基团为ROX，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.6所示的探针5’端连接的荧光报告基团为CY5，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ2；
所述SEQ ID No.9所示的探针5’端连接的荧光报告基团为FAM，3’端连接的非荧光淬灭基团为BHQ1；
所述引物组的工作浓度为：SEQ ID No.1所示的上游引物0.01-0.15μmol/L、SEQ IDNo.2所示的下游引物0.1-1.5μmol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.02-0.6μmol/L；
SEQ ID No.4所示的上游引物0.01-0.15μmol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.2-3.0μmol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.05-0.7μmol/L；
SEQ ID No.7所示的上游引物0.02-0.3μmol/L、SEQ ID No.8所示的下游引物0.2-3.0μmol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.01-0.2μmol/L。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包含以下组分：PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs和DNA聚合酶；所述PCR缓冲液包含Tris-HCl和KCl。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 1-25mmol/L、KCl 15-90nmol/L、Mg2+1.3-5.8mmol/L、dNTPs0.16-0.7mmol/L和DNA聚合酶0.02-0.28U/μl。
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，各组分反应时的终浓度为：Tris-HCl 10mmol/L、KCl 50nmol/L、Mg2+3.75mmol/L、dNTPs0.3125mmol/L、SEQ ID No.1所示的上游引物0.025μmol/L、SEQ ID No.2所示的下游引物0.25μmol/L、SEQ ID No.3所示的探针0.1μmol/L、SEQ ID No.4所示的上游引物0.025μmol/L、SEQ ID No.5所示的下游引物0.5μmol/L、SEQ ID No.6所示的探针0.25μmol/L、SEQ ID No.7所示的上游引物0.05μmol/L、SEQID No.8所示的下游引物0.5μmol/L、SEQ ID No.9所示的探针0.025μmol/L和DNA聚合酶0.05U/μl。
5.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测程序为：95℃3min；10个循环：95℃15s、64℃30s、72℃30s；40个循环：95℃15s、54℃30s收集荧光、72℃30s；1个循环：95℃3min、50℃2min；1个循环：50℃1min、80℃15s，收集荧光，升温速率为0.06℃/s。
6.根据权利要求1～4任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在用于检测时的结果判断标准为：
(1)ADH1B基因rs1229984，c.143GA多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：71.96±0.99℃，单峰；
(2)ADH1B基因rs1229984，c.143GA多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为71.96±0.99℃或者Tm值为66.31±0.99℃，双峰；
(3)ADH1B基因rs1229984，c.143GA多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：66.31±0.99℃，单峰；
(4)ALDH2基因rs671，c.1510GA多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：68.83±0.99℃，单峰；
(5)ALDH2基因rs671，c.1510GA多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为68.83±0.99℃或者Tm值为64.13±0.99℃，双峰；
(6)ALDH2基因rs671，c.1510GA多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：64.13±0.99℃，单峰；
(7)GABRA2基因rs279845，c.255+4909AT多态性位点野生型：Ct值小于32；Tm值：64.99±0.99℃，单峰；
(8)GABRA2基因rs279845，c.255+4909AT多态性位点杂合突变型：Ct值小于32；Tm值为64.99±0.99℃或者Tm值为60.24±0.99℃，双峰；
(9)GABRA2基因rs279845，c.255+4909AT多态性位点纯合突变型：Ct值小于32；Tm值：60.24±0.99℃，单峰。
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