[发明专利]一种引物探针组合物及其应用

说明书

本发明提供了一种引物探针组合物及其应用，所述组合物包括四条探针及十二条引物，其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑12所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.13‑16所示；本发明针对雄激素受体V7的目的区域设计特异性的引物和探针，以引物探针组合物为基础，摸索实验条件，优化检测体系，二者相辅相成，实现高灵敏度和强特异性的检测，特异性地定量检测人类AR‑V7表达量，检测样品范围广，检测灵敏度高，操作方便，简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种引物探针组合物及其应用。

背景技术

前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，雄激素受体(AR)在前列腺癌的发生、发展中起着重要作用，其通过调节下游基因的表达，促进前列腺癌的进展和转移。手术治疗仍然是早期前列腺癌的一线治疗方案，晚期前列腺癌的治疗方法主要是内分泌治疗，即雄激素剥夺治疗(ADT)。美国FDA已经批准包括CYP17A1抑制剂阿比特龙和强效抗雄激素药物恩杂鲁胺作为治疗转移性前列腺癌的二线治疗方案。但在前列腺癌的治疗过程中，常常对其产生耐药，并发展成为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。患者经阿比特龙和恩杂鲁胺治疗，AR-V7阳性患者与阴性患者相比，临床或影像学无进展生存时间和总体生存时间都明显缩短。

AR基因位于X染色体q11-12，包含由8个外显子组成的一个2757bp的阅读框架，分子质量约110kb。全长的AR(AR-FL)包含四个结构：(1)氨基端结构域(amino-terminaldomain，NTD)，由exon 1编码，包含555个氨基酸，占了AR蛋白总长度的60％左右；(2)DNA结合域(DNA binding domain，DBD)，由exon 2和3编码，包含68个氨基酸；(3)铰链区(Hingedomain，HD)，连接DBD和LBD；(4)配体结合域(Ligand binding domain，LBD)，由exon 4-8编码，包含295个氨基酸。AR-Vs的产生是通过AR基因重组、AR前mRNA剪接或基因突变等机制，AR-V7(又称AR3)是最常见的AR-Vs。AR-V7具有完整的NTD结构域和DBD结构域，但缺乏LBD结构域和铰链区，代之而起的是神秘外显子3(CE3)编码的一段短肽序列。而LBD结合域是恩杂鲁胺所针对的靶点，从而导致患者产生耐药。因此，AR-V7参与了恩杂鲁胺和阿比特龙耐药性的发展。

根据最新的研究资料表明(Anna Katharina Seitz et al.AR-V7in PeripheralWhole Blood of Patients with Castration-resistant Prostate Cancer：Associationwith Treatment-specific Outcome Under Abiraterone and Enzalutamide，EuropeanUrology,2017.)，基于数字PCR平台检验了85例用阿比特龙或恩杂鲁胺治疗的患者及28例健康人做对照，以确定AR-V7表达量的背景值。研究发现在健康人中AR-V7最高的表达量为0.6％，以此将AR-V7的表达量划分为高表达组(AR-V7/AR-FL0.6％)与低表达组(AR-V7/AR-FL≤0.6％)。在85例用阿比特龙或恩杂鲁胺治疗的患者中高AR-V7表达水平达到18％，且无PSA应答，而仍有部分低AR-V7表达的患者有PSA应答。高AR-V7表达水平的患者无进展生存期更短(median 2.4vs 3.7months；p0.001)，总生存期也更短(median4.0vs.13.9months；p0.001)。有此可得出，AR-V7的表达量差异会导致CPRC患者的PSA应答(耐药性)以及生存期的差异，因此，准确检测AR-V7的表达量是十分必要的。CN108070641A公开了一套基于qPCR或数字PCR技术开发的用于检测囊泡中AR-V7及AR的引物及探针，序列分别如SEQ ID NO:1-6所示，利用所述引物及探针建立了一种基于囊泡的无创、快速、高灵敏度的AR-V7及全长AR的qPCR或数字PCR检测方法。该体系及其数字PCR方法采用单荧光检测，只能计算拷贝数，不能直接反映AR-V7在mRNA水平上的表达百分比。