[发明专利]一种尿液游离DNA提取试剂盒及提取方法

权利要求书

1.一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、洗涤液A、洗涤液B、洗脱液和羟基磁珠；

所述裂解液包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠；

所述洗涤液A包括胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为30％～40％；

所述洗涤液B包括金属螯合剂、表面活性剂、乙醇和Tris-HCl，所述乙醇的体积浓度为75％～85％。

2.根据权利要求1所述的一种尿中游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述胍盐选自盐酸胍和异硫氰酸胍中的一种或两种，所述金属螯合剂选自乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠和乙二胺四乙酸二钾中的一种或多种；所述表面活性剂选自Triton X-100、Tween-20、NP-40、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠中的一种或多种，所述醇类为乙醇和异丙醇中的任一种或两种。

3.根据权利要求2所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述胍盐为异硫氰酸胍，所述金属螯合剂为乙二胺四乙酸，所述表面活性剂为Triton X-100，所述醇类为异丙醇。

4.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂、醇类、Tris-HCl和氯化钠的工作浓度分别为3～5M、20～30mM、4％～6％(v/v)、30％～50％(v/v)、40～60mM和90～110mM，所述裂解液的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液A中胍盐、金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为2.5～3.5M、0.5～1.5mM、0.8％～1.2％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液A的pH值为7.0～8.0；所述洗涤液B中金属螯合剂、表面活性剂和Tris-HCl的工作浓度分别为0.5～1.5mM、0.08％～0.12％(v/v)和8～12mM，所述洗涤液B的pH值为7.0～8.0。

5.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液中含有0.4～0.6mM的EDTA和8～12mM的Tris-HCl，所述洗脱液的pH为7.5～8.5。

6.根据权利要求1所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述羟基磁珠为表面修饰有硅羟基的超顺磁性纳米微球，所述羟基磁珠以磁珠混悬液的形式存在，所述羟基磁珠的浓度为40～60mg/mL。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种尿液游离DNA提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白酶K。

8.一种尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒进行提取，包括以下步骤：

(a)将尿液样品进行预处理，然后加入裂解液和羟基磁珠，上下颠倒混匀，孵育；

(b)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；

(c)加入洗涤液A，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；

(d)加入洗涤液B，悬浮，磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时去除液体；

(e)重复步骤(d)，并去除残留的乙醇；

(f)加入洗脱液，重新悬浮，孵育，期间晃动使核酸充分洗脱；

(g)磁力吸附，待羟基磁珠完全吸附时将核酸溶液转移，得到游离DNA提取液。

9.根据权利要求8所述的尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(a)中加入蛋白酶K。

10.根据权利要求9所述尿液游离DNA的提取方法，其特征在于，步骤(a)中，所述裂解液的添加体积为预处理后尿液样品体积的1～2倍，以每mL预处理后的尿液样品计，蛋白酶K的添加量为1～3mg，羟基磁珠的添加量为0.15～1mg，孵育时间为30min，孵育时，上下颠倒混匀；步骤(c)中，所述洗涤液A的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；步骤(d)中所述洗涤液B的添加体积为预处理后尿液样品体积的0.3～0.5倍；所述步骤(c)和步骤(d)中的悬浮为：涡旋使羟基磁珠充分悬浮；所述步骤(c)和步骤(d)中的去除液体为：吸弃液体，并离心去除容器内壁的液滴；步骤(f)中，所述洗脱液的添加体积为预处理后尿液样品体积的2％-5％，所述孵育的温度为55℃～58℃，孵育时间为5～10min。