[发明专利]只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用

说明书

本发明公开了只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明敲除谷氨酸棒杆菌中BCAT编码基因ilvE，过表达来自大肠杆菌W3110的tyrB基因和谷氨酸棒杆菌ATCC13032中的aspB基因，分析其对三种支链氨基酸的催化合成作用，解决发酵过程中三种氨基酸同时存在的问题。此发明通过优化转氨酶基因，成功找到两种转氨酶基因只对L‑亮氨酸有作用，消除了其他两种氨基酸作为副产物的影响，为选育只产特定支链氨基酸菌株提供了崭新的思路。

技术领域

本发明涉及只产一种支链氨基酸的重组菌及其应用，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

支链氨基酸包括L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸，属于必需氨基酸，高等生物体不能自身合成，需要从外界摄取。支链氨基酸在生理功能和代谢中具有重要作用，可用于膳食产品，药品和化妆品和饲料行业。另外，支链氨基酸还具有非常好的抗分解作用，有助于预防蛋白分解和肌肉丢失。由于微生物发酵法具有生产成低、反应条件温和，污染小等优点，而成为了当今工业生产支链氨基酸的主要方法。

支链氨基酸的合成途径是一个平行途径并且相互关联，在生物合成途径中，存在着多种共用酶。L-缬氨酸和L-异亮氨酸是从磷酸烯醇式丙酮酸开始分支，由乙酰羟酸合成酶(AHAS)、乙酰羟酸异构体还原酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)、支链氨基酸转氨酶(BCAT)四种共用酶催化反应；由L-缬氨酸合成途径中的α-酮基异戊酸分支一条途径，在α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)、α-异丙基苹果酸异构酶(IPMI)、α-异丙基苹果酸脱氢酶(IPMD)和支链氨基酸转氨酶(BCAT)酶的催化下合成L-亮氨酸。支链氨基酸转氨酶是三种氨基酸共用的最后一个酶，是催化合成氨基酸的最后一步。

由ilvE基因编码的支链氨基酸转氨酶(BCAT)是5’-磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶，属于IV折叠型，涉及到三种氨基酸和酮酸之间的转氨转移。由于此酶是三种氨基酸合成中的共用酶，若过表达ilvE基因，则三种支链氨基酸会同时增加，无法得到唯一的一种氨基酸。

发明内容

基于上述问题，本发明将谷氨酸棒杆菌Cornebacterium glutamiucm支链氨基酸合成途径中的参与最后一步反应的共用酶BCAT基因敲除，获得一株支链氨基酸缺陷型的基因工程菌株C.glutamiucm△ilvE，首次将来源于大肠杆菌(E.coli)的芳香族氨基酸转氨酶(TyrB)和来自谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的天冬氨酸转氨酶(AspB)，引入到该菌株中，重组菌株经发酵只产生L-亮氨酸，解决了C.glutamiucm发酵过程中同时生产三种支链氨基酸的缺点，并且得到了只产一种支链氨基酸的菌株。

本发明的第一个目的是提供只产一种支链氨基酸的谷氨酸棒杆菌重组菌，所述重组菌是在谷氨酸棒杆菌的基础上敲除了支链氨基酸转氨酶基因，并且过表达了芳香族氨基酸转氨酶或者天冬氨酸转氨酶。

在本发明的一种实施方式中，所述芳香族氨基酸转氨酶来源于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述芳香族氨基酸转氨酶基因是来源于大肠杆菌W3110的tyrB。

在本发明的一种实施方式中，芳香族氨基酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶来源于谷氨酸棒杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述天冬氨酸转氨酶基因是来源于谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中的aspB基因。

在本发明的一种实施方式中，天冬氨酸转氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌是以谷氨酸棒杆菌C.glutamicum FA-1为宿主构建得到的。所述C.glutamicum FA-1为异亮氨酸缺陷型。