[发明专利]一种高产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高产L‑亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程领域。本发明应用基因工程方法，替换谷氨酸棒杆菌中NADP依赖型支链氨基酸转氨酶为来源于球形芽孢杆菌NAD依赖型亮氨酸脱氢酶LeuDH，构建新的、高效的L‑亮氨酸合成途径并解决谷氨酸棒杆菌L‑亮氨酸产生菌中NADH积累量过多，NADPH供应量不足的缺点，增强重组菌株中L‑亮氨酸合成能力并提高菌株积累NADPH的能力。重组菌经摇瓶发酵实验，L‑亮氨酸积累量达16.7g·L^‑1，最大比生长速率为0.23g·L^‑1·h^‑1，高于出发菌株的13.2g·L^‑1和0.18g·L^‑1·h^‑1。此发明成功改造了谷氨酸棒杆菌中L‑亮氨酸合成途径，改善了胞内辅因子不平衡的缺点，为选育L‑亮氨酸高产菌提供了新的思路。

技术领域

本发明涉及一种高产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌重组菌及其构建方法，属于基因工程领域。

背景技术

L-亮氨酸，又名白氨酸，其化学名称为α-氨基-γ-甲基戊酸，α-氨基异己酸，与L-缬氨酸、L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。由于人和哺乳动物都不能自身合成这三种氨基酸而必需依赖外源供给，故三者也都同属于必需氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品添加剂，制药行业，化妆品行业和动物饲料添加剂行业。同时，也广泛用于临床作为复合氨基酸静脉注射液。因此，选育具有自主知识产权的高L-亮氨酸合成、低副产物积累的生产菌株，实现企业可持续发展具有重要意义。

L-亮氨酸的生产方法主要有提取法，化学合成法，添加前体物质发酵法，直接发酵法等。微生物发酵法反应条件温和，环境友好，产品质量稳定，是L-亮氨酸的主要生产方法。L-亮氨酸产生菌多为随机突变获得，通常用谷氨酸棒杆菌，乳糖发酵短杆菌和黄色短杆菌作为宿主菌，诱变处理，选出营养缺陷型或者氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节过程中反馈阻遏和抑制，达到过量积累L-亮氨酸的目的。然而，化学诱变筛选氨基酸产生菌有很多问题，如产生不必要的突变，生成副产物，菌体生长缓慢等。

亮氨酸脱氢酶(Leucine dehydrogenase，LeuDH)是一种NAD依赖型的氧化还原酶，它可逆的催化L-亮氨酸和其他支链氨基酸反应生成对应的酮酸及其类似物，可用于测定支链脂肪酸及其酮酸类似物，同时可催化酮酸还原制备L-亮氨酸及L-叔亮氨酸等氨基酸。该酶在芽孢杆菌中有较高的表达水平，主要参与支链L-氨基酸的体内代谢。Sanwal和Zink于1961年首先在芽孢杆菌属的Bacillus cereus发现并纯化了亮氨酸脱氢酶，此后Bacillussphaerius、Bacillus stearothermophlius、Clostridium thermoaceticum等产LeuDH菌株相继被筛选出来。该酶分子量约40kDa，由六个相同亚基组成，酶反应时需要NADH为辅因子。然而，作为主要的支链氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌却不存在该酶。有文献指出在谷氨酸棒杆菌中异源表达LeuDH，能够改变L-缬氨酸合成途径中辅因子NADPH的供应，从而有利于L-缬氨酸合成。因此，筛选得到以NADH为辅因子的亮氨酸脱氢酶是改善L-亮氨酸产生菌胞内辅因子不平衡的关键。

代谢工程提供了一个有效的可替代传统诱变的育种方法。但是现有的通过代谢途径改造的L-亮氨酸生产菌依然存在产量低，副产物含量高的问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明首次将来源于球状芽孢杆菌(B.sphaericus)中以NADH为辅因子的LeuDH引入到谷氨酸棒杆菌的L-亮氨酸产生菌中，提高了重组菌株中L-亮氨酸的产量，并且有效降低副产物含量。

本发明的第一个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌，所述重组菌是在生产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌中异源表达了芽孢杆菌属来源的亮氨酸脱氢酶。