[发明专利]标记组合物及羟甲基化核酸文库的构建方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及标记组合物及羟甲基化核酸文库的构建方法。本发明利用UDP‑6‑N3‑Glu和βGT对基因组DNA进行双重标记；此外本发明还利用生物素进行特异性标记，使得带有5hmC修饰的DNA片段能够尽可能的全被捕获下来；捕获的DNA利用NEB相关试剂进行文库建设，能够保证文库的质量较优，使测序结果变的稳定可靠。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及标记组合物及羟甲基化核酸文库的构建方法。

背景技术

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是早在1952年发现的存在于噬菌体中胞嘧啶的一种修饰形式，也是最近同时在小鼠的神经元和胚胎干细胞中检测到的存在于哺乳动物基因组中的又一种修饰方式。随后，大量的研究集中于揭示5hmC和TET蛋白家族氧化酶在基因组组织以及鼠干细胞分化中可能承担的角色，并且证明TET蛋白酶家族可以通过氧化作用将5mC转换为5hmC。而Tet家族酶与疾病的发展与调控有关。已报道TET蛋白和5hmC存在于许多不同的组织中，并且它们的表达/活性在胚胎干细胞分化过程中受到严格调控。TET1和TET2均与癌症有关：TET1在急性骨髓样白血病(AML)和急性淋巴样白血病(ALL)中是MLL的的一个配体，而TET2功能的缺失也与急性骨髓样白血病(AML)以及各种骨髓细胞生成障碍综合征和骨髓增生性疾病密切相关。TET蛋白和hmC引起DNA甲基化失调，在胚胎干细胞多潜能性，致癌性转化以及神经元的功能中可能具有重要作用。

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是被称之为第6种碱基的一种新的表观遗传学修饰，它是由Tet(Ten-Eleven-Translocation)家族在铁离子与α-酮戊二酸存在的条件下氧化5-甲基胞嘧啶(5mC)而来。目前研究检测发现，在受精卵、胚胎干细胞以及脑组织中，5hmC的含量都相当丰富，而脑组织以及胚胎干细胞中几乎是其他组织的十倍，因此为进一步研究其生物学功能提供了线索。

目前用来检测5hmC的主要方法是亚硫酸氢钠法和β糖基转移酶(β-glucosyltransferase，βGT)法。研究人员报道在在经过亚硫酸氢钠处理之后，5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)会转变为5-亚甲基磺酸盐形式的胞嘧啶(cytosine5-methylenesulfonate，CMS)，这种磺酸盐形式的胞嘧啶的脱氨基速率比甲基胞嘧啶更慢。在经过PCR信号扩增之后，5-羟甲基胞嘧啶位置的测序结果也会显示为胞嘧啶。因此，传统的亚硫酸氢钠法测序并不能完整地反映基因组中各种碱基的真实分布情况，人们迫切需要寻找新的方法来解决5-羟甲基胞嘧啶检测的问题。

现有技术通过βGT处理基因组DNA，利用MSPI酶进行切割，连接接头，BST酶处理修复，EcoP15I酶切，片段选择，连接P7接头，PCR扩增建立文库。但是上述实验步骤繁琐，需要多种酶进行切割连接；且容易丢失5hmC修饰的DNA片段，造成测序结果不准确。

因此，提供一种5-羟甲基胞嘧啶的检测方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种标记组合物及羟甲基化核酸文库的构建方法。利用UDP-6-N3-Glu和βGT对基因组DNA进行双重标记；此外还利用生物素进行特异性标记使得带有5hmC修饰的DNA片段能够尽可能的全被捕获下来；捕获的DNA我们利用NEB相关试剂进行文库建设，能够保证文库的质量较优，使测序结果变的稳定可靠。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种标记组合物，包括UDP-6-N3-Glu和βGT。

在本发明的一些具体实施方案中，所述标记组合物还包括生物素。

在此基础上，本发明还提供了所述标记组合物在检测核酸羟甲基化修饰中的应用。

本发明还提供了所述标记组合物在制备核酸羟甲基化修饰的检测制剂和/或检测试剂盒中的应用。