[发明专利]一种T载体的制备方法

说明书

本发明公开了一种T载体的制备方法，利用硫代修饰引物扩增质粒载体；用限制性核酸内切酶Dpn I对模板质粒分子进行消化处理，消除环状质粒模板导致的阴性背景克隆；将PCR扩增的线性化载体进行5’外切核酸酶消化处理，得到T载体。通过上述方式，本发明的方法直接简单的PCR扩增即可制备T载体的线性化片段，消除了限制性核酸内切酶法和末端脱氧核苷酸转移酶法的技术缺陷，简单处理便能得到T载体。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种T载体的制备方法。

背景技术

基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。传统基因克隆缺点主要有：1）限制性内切酶的选择较为麻烦，对于长片段基因经常找不到合适好用的限制性酶切位点，导致无法进行该基因的克隆；2）不同基因选择的内切酶不一样，需要要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因。

为了解决上述技术缺陷，发明了T载体和TA克隆技术。T载体是线性化载体DNA的3’端附加了一个单链状态T碱基的载体。Taq DNA聚合酶等可以在目标基因的PCR产物的3’端加上一个单链状态的A碱基。将带3’A碱基的目标基因与T载体混合，A-T配对后，在DNA连接酶的作用下，将二者连接在一起，形成闭环重组DNA。基于T载体的TA克隆的操作通量大，可以用于高通量基因克隆，同时克隆几百个基因，因此正在替代基于限制性内切酶的传统基因克隆技术。

目前制备T载体的方法主要有限制性酶切法、末端脱氧核苷酸转移酶法，但二者都有一定缺陷。限制性酶切法可用的限制性酶有限，只有少数几种，价格昂贵，而且要在原始载体的多克隆位点区域预先引入这种专门制备T载体的酶切位点（前后两个），导致每构建一种新的T载体就要制备一种这种特定的原始载体，非常耗时，且通用性极差。另外酶切后要把切掉的小片段去除，不然在DNA连接酶反应中会被重新连接形成空载体。更大的缺点是，酶切反应的好坏直接决定着T载体能否制备成功，如果酶切不彻底，剩余的环状载体和只发生单一位点酶切的载体，在后续的DNA连接反应中会产生大量的空载体（不含目的基因），导致阳性克隆率过低，筛选不到阳性克隆。末端脱氧核苷酸转移酶法先用平末端限制性内切酶，例如EcoRV，将环状质粒切成平末端的线性质粒，然后利用末端脱氧核苷酸转移酶在双链DNA的3’末端加上一个T碱基，从而制备T载体。该方法虽然能够制备T载体，但由于末端脱氧核苷酸转移酶能够在3’末端加上一个到数个T碱基，因而很难控制在末端加上的T碱基的数量，而只有加一个T碱基的情况才是需要的T载体。另外两种方法中环状模板质粒分子的去除都没有好的策略，会带来较高的阴性克隆背景。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种T载体的制备方法，得到的T载体可以用于TA克隆中，也可用于需要进行DNA文库构建的基因克隆、精准医疗、病毒载体构建等领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种T载体的制备方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用硫代修饰引物PCR扩增模板质粒载体，得到线性化质粒载体；（2）用限制性核酸内切酶Dpn I对步骤（1）得到的线性化质粒载体中的模板质粒载体进行消化处理；（3）根据步骤（1）中引物的修饰特征，对步骤（2）处理后的线性化质粒载体PCR片段进行5’外切核酸酶处理，纯化处理的线性化质粒载体PCR片段，得到T载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤（1）中所述硫代修饰引物的序列特征为：（a）5’端第1位的碱基为DNA碱基A；（b）5’端第2个磷酸二酯键起始的一个或连续多个磷酸二酯键为硫代修饰；（c）3’端碱基序列与模板质粒载体的DNA片段配对。