[发明专利]一种由3种组织因子为靶点的靶向片段

说明书

本发明涉及以TF为靶点的靶向治疗，提供了4种TF靶向片段。这4种靶向片段的氨基酸构成、碱基序列均已给出，而且比较了4种靶向片段对TF的亲和力。这4种靶向片段均可以用于构建TF靶向药物，也可以直接用于TF的靶向治疗，对表达TF的各种肿瘤、肿瘤血栓等疾病具有治疗作用。

技术领域

本发明涉及肿瘤靶向治疗领域，尤其涉及一种以组织因子(tissue factor，TF)为靶点的靶向治疗。

背景技术

靶向片段是构建靶向药物的关键元件。一种理想的靶向片断需要符合以下基本条件：(1)与靶标有高度结合能力；(2)和靶标结合后不会激发不需要的级联反应；(3)靶向片断多为小分子化合物，易于基因工程的插入、酶切和修饰。通常用来作为靶向片断的分子有：(1)单克隆抗体；(2)受体的天然配基；(3)噬菌体展示技术或其它方法筛选出来的高亲和力靶向片断。

噬菌体展示技术是一种能筛选出蛋白特异性高亲和力配体方法，在靶向药物的靶向片段筛选中得到广泛应用。已经证实通过该项技术可以筛选出特异性强、敏感性高的小分子靶向片断。一般情况下，采用噬菌体技术筛选跨膜蛋白的靶向片断，通常需要预先合成胞膜外段，再以之为靶标筛选高亲和力靶向片段。但由于人工或生物合成的胞膜外结构已经和整个蛋白结构发生了构型改变，筛选结果是否代表最佳的高亲和力靶向片段尚有争论。而且，生物合成跨膜蛋白的胞膜外部分也是一项复杂的生物工程。但目前没有满意的利用噬菌体展示技术筛选跨膜蛋白方法。

TF被认为是一种理想的抗肿瘤靶向受体，在肿瘤细胞和肿瘤血管均有特异性的高表达，以TF为靶点的药物即能抗肿瘤细胞又能抗肿瘤血管。但是，目前所构建的以TF为靶点的靶向药物中，其靶向片断均存在一些缺陷。TF单克隆抗体与TF的亲和常数(Kd)是10-8—10-9M，远低于其高于其天然配基第七因子(factor VII，fVII)的10-8—10-9M，也即TF单克隆抗体与TF的亲和力只有fVII的1000-10000分之一。但是，以fVII为靶向片断，虽然亲和力高，但和TF结合后容易引起出血。因此，两者作为TF靶向药物的靶向片段均有缺点。

耶鲁大学癌症中心Garen教授等研究了一种TF的靶向片断-----fVII的点突变体，即采用分子生物学技术在fVII的第341位氨基酸进行改型，期望保留fVII与TF的高亲和力，又在和TF结合后不会引起凝血。以此为靶向片断构建的Icon-1证实具有良好的靶向作用，Icon-1也获得了期望的抗肿瘤血管作用。但对凝血系统还是有干扰作用，而且分子量太大不利于靶向药物的构建，其腺病毒载体抗肿瘤效果良好，但分泌蛋白却显示不出明显的抗肿瘤效应。

近年来，fVII晶体研究表明，fVII的结构分成轻链和重链两部分，轻链和重链之间仅靠单一的二硫键连接。fVII轻链的功能主要与其靶向TF的功能有关，而重链的生理功能在于fVII与TF结合后，激发凝血反应，专利申请者曾以fVII轻链作为构建以TF为靶点的靶向药物的靶向片断，有一定的治疗效果，目前专利也在申请之中。这种TF靶向片段与TF有高亲和力，不引起凝血和出血反应，但分子量大，稳定性低。因此，有必要寻找更好的TF靶向片段。

发明内容

为克服以上TF靶向片段的不足，本发明采用改良的噬菌体展示技术帅选出了一种高效的TF小分子靶向片段，经验证，具有很好的TF靶向作用，分子量小，生物学行为稳定，适用于构建TF的靶向药物，也可以直接用于以TF为靶点的靶向治疗。

本发明的技术方案为：

(1)靶向片段的筛选方法：采用完整的TF合成蛋白和表达TF的肿瘤细胞-HT-29结肠癌细胞为靶标，进行蛋白和细胞交替筛选的方法筛选TF先导肽，采用噬菌体展示技术筛选跨膜受体的靶向片断的方法进行序贯筛选，不断提升筛选条件，最后获得4种与TF具有最高亲和力的靶向7肽；

(2)以竞争抑制实验和Elisa法检测和比较利用上述方法筛选的4种TF靶向肽、fVII轻链和fVII与TF的亲和力，从中选出适合TF的合适靶向片断；