[发明专利]一种柱前衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖含量的方法

说明书

本发明公开了一种柱前衍生化HPLC‑MS/MS检测桂花中单糖组分的方法。本发明以1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化为前处理手段，采用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用对桂花中的6种单糖成分进行同时测定，方法简单、灵敏、选择性高、分离效率高、进样量少、分析时间短、多模式测定等优点，为桂花中多糖的单糖成分研究提供科学依据。该方法同时为其他天然产物的研究奠定了基础。

技术领域

本发明属于多糖组分分析领域，具体涉及一种柱前衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖组分的方法。

背景技术

桂花(Osmanthus fragrans Lour)属于木犀科(Oleaceae)，是一种观赏植物，在中国南方和中部地区被用作传统民间药物，用于治疗多种疾病。其在中国用作药用植物数千年，并具有广泛的生物学效应，包括可以减弱炎症，作为抗氧化剂起作用，防止衰老并抑制黑素生成。此外，桂花提取物中的主要生物活性成分是类胡萝卜素和酚酸。来自天然药物多糖的分析是广泛的。多糖作为药物研究始于20世纪50年代，截至目前，已发现数百种多糖具有生物活性。多糖在抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、促进免疫等方面都发挥着重要生物活性，而且多糖是生物体内非常重要的一类有机化合物，除参与生物体的构造，作为能源物质、细胞识别的信息分子外，还参与体内物质转化代谢生成为生物体必须的氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。桂花多糖是桂花的重要成分之一，但是目前对桂花的研究主要集中在桂花精油方面，而对桂花多糖的单糖成分则很少有报道。

HPLC-串联质谱法(HPLC-MS/MS)以其专属性强、灵敏度高等优势在中药有效成分含量测定中应用日益广泛。在过去十年中，专门用于分析糖和单糖的HPLC-MS方法的开发已经在灵敏度和特异性方面取得了显着进步，同时保持了实施的速度和简单性。然而，由于单糖的低电离效率，HPLC-MS方法受到灵敏度损失的限制，因此，单糖的衍生化对于获得高灵敏度检测是必不可少的。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化高效液相色谱法反应条件较温和，产物无立体异构，紫外检测灵敏度较高，故得到较为广泛的应用。然而，PMP柱前衍生化高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用分析方法在桂花上的应用尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术不足而提供一种测定六种糖的柱前PMP衍生化HPLC-MS/MS方法。已经收集了六种PMP衍生的单糖的特征性碎片离子的数据。通过检测反应时间和中和条件，优化了柱前衍生化反应的步骤。应用该方法对三种不同品种的桂花中单糖含量进行分析，为桂花资源的开发利用提供依据。

本发明采取的技术方案为：

一种柱前PMP衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖组分的方法，包括步骤如下：

(1)样品处理

a、桂花中多糖的提取

准确称取10g桂花、200ml的无水乙醇放入500ml圆底烧瓶后进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时，过滤后取滤渣将此操作重复一次，再次过滤和干燥；然后再将得到的滤渣放置在1000ml的圆底烧瓶中并放入400ml的水，90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后得到滤液，合并两次的滤液，将滤液在旋转蒸发仪内蒸发浓缩至150ml；将4倍体积的无水乙醇加入此浓缩的多糖溶液中，后经离心机离心15min(8000r/min)，干燥得到桂花粗多糖；将蒸馏水加入粗多糖溶解，再加入10ml的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到桂花多糖；

b、桂花中多糖的酸水解

准确称取步骤a获得的桂花多糖10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加5ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液单糖样品水解液，待衍生化；