[发明专利]一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，为解决目前并无有效方法可对带纹条鳎和角鳎进行快速准确地鉴定，而仅基于传统的形态学观察其生物形态特征容易导致种类鉴定及系统进化上的混乱等问题，本发明提供了一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。本发明所提供的引物可以高效和特异地扩增带纹条鳎和角鳎的ITS1‑5.8S‑ITS2 rDNA序列，并能够一次性对两种物种同时进行扩增，具有高效快速和便捷的优点，且引物在ITS1‑5.8S‑ITS2 rDNA序列扩增后，可直接通过凝胶电泳肉眼观察ITS1的长度异质性对其进行物种鉴别，节约了成本，更重要的是大大提高了工作效率并且准确度十分高。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。

背景技术

带纹条鳎和角鳎同属鲽形目鳎科，形态上非常相近，主要通过眼间隔处有无鳞片、尾部斑点颜色进行区分。但是由于其离水后斑点颜色很容易发生变化，且鳞片也很容易脱落，导致两者很难基于传统的形态学进行鉴定，因而导致种类鉴定及系统进化上的混乱。

核糖体ITS区域(ITS1-5.8S-ITS2)是一段位于核糖体RNA编码基因18S rDNA和28SrDNA中间的一段基因，包括两段非编码区(ITS1和ITS2)和一段编码区(5.8S rDNA)，其进化速率相对较快，在种内基本趋于相似，而在种间则表现出显著的差异，且不同种类的 ITS长度差异非常明显。

发明内容

为解决目前并无有效方法可对带纹条鳎和角鳎进行快速准确地鉴定，而仅基于传统的形态学观察其生物形态特征容易导致种类鉴定及系统进化上的混乱等问题，本发明提供了一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物及其设计方法和应用方法。其首先要实现对引物快速有效地设计和制备的目的，并通过该引物实现对带纹条鳎和角鳎进行快速有效的鉴定的目的。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物，所述用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物中正向引物为SEQ ID NO.1：5’-TCGCTACTACCGATTGGATGGTTTA-3’，反向引物为SEQ IDNO.2：5’-GCTCTTCCCTCTTCACTCG-3’。

一种用于快速鉴别带纹条鳎和角鳎的引物的设计方法，所述方法为：Genbank数据库中下载带纹条鳎和角鳎的rDNA序列，对这些序列进行多重比对，分别在3’端和5’端找出比较保守的序列以及变异较大的区域，并在两端保守的18S rDNA和28S rDNA上设计引物，扩增出两种形态非常接近的鳎类ITS1-5.8S-ITS2序列。

一种上述引物的应用方法，所述引物可用于对带纹条鳎和角鳎的鉴定。

作为优选，所述鉴定包括以下步骤：

1)DNA抽提试剂盒法提取待测带纹条鳎和角鳎的rDNA；

2)采用权利要求1中所述的引物，并以待测带纹条鳎和角鳎的rDNA作为模板，进行PCR扩增，得到扩增产物；

3)对扩增产物进行凝胶电泳，试剂盒法割胶回收扩增片段，对回收得到的扩增片段进行观察和鉴定。

作为优选，步骤1)所述提取rDNA时为避免肠道内容物污染，舍去其头颈部，仅从其尾部提取rDNA。

作为优选，步骤2)所述PCR扩增的反应体系组成为：2.5mM的dNTP2μL、10× TaqDNA聚合酶Buffer2.5μL、10μM的正向引物SEQ ID NO.1和反向引物SEQ ID NO.2各 1μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶0.2μL、100g/μL的rDNA模板溶液1μL及灭菌双蒸水 17.3μL；