[发明专利]抑制pirB表达的短发卡shRNA、慢病毒及其应用

说明书

本发明公开了一种抑制pirB表达的短发卡shRNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的碱基序列，本发明还公开了一种pirB基因shRNA敲除慢病毒表达载体，将上述的抑制pirB表达的短发卡shRNA插入慢病毒载体质粒pGLVH3/H1/GFP+Puro所得；以及一种pirB病毒的制备方法制备得到pirB病毒；以及抑制pirB表达的短发卡shRNA或pirB基因shRNA敲除慢病毒表达载体或pirB病毒在制备抑制肺癌增殖或迁移的药物中的应用，为肺癌的治疗应用提供了一种新方法。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种抑制pirB表达的短发卡 shRNA，本发明还涉及一种pirB基因shRNA敲除慢病毒表达载体、pirB病毒及其应用。

背景技术

原发性肺癌是我国及至全球发病率最高的肿瘤，也是癌症死因之首。《2015年中国癌症统计》报告估计，中国2015年新增429.2万癌症病例，死亡病例超过281.4万，其中肺癌的发病率和死亡率均占首位。非小细胞性肺癌(NSCLC)是肺癌中最常见的类型，约占肺癌总发病率的75％～80％。目前NSCLC的治疗主要采取综合治疗与个体化治疗相结合的原则，即应用手术、化疗、放疗和分子靶向治疗等手段，达到延长患者生存时间、控制肿瘤进展的目的。

pirB，也称为LILRB3，是一种I型跨膜糖蛋白，由胞外四个免疫球蛋白样(IgG)结构域和胞内四个ITIMs组成。早期研究发现pirB在树突状细胞、 B细胞、粒细胞及肥大细胞等细胞表面高表达，认为其作为抑制性白细胞免疫球蛋白样受体，通过胞外段的IgG样结构域与胞外的配体结合，传导抑制信号介导机体的炎症和免疫反应。但是pirB在肿瘤中的作用鲜有报道。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，是一种转录后基因沉默的机制。目前RNAi的表达载体有很多中，慢病毒表达系统相比于其他表达系统，具有感染效率高、感染时间长、感染效果稳定，可容纳较大的基因片段，不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的热点。

目前尚无研究表明pirB基因与肺癌发生发展相关，也无文献表明抑制 pirB的表达可以抑制肺癌细胞的增殖、迁移。

发明内容

本发明的目的是提供一种抑制pirB表达的短发卡shRNA，能抑制肺癌细胞的增殖、迁移，为肺癌的治疗应用提供了一种新方法。

本发明的另一目的是提供一种pirB基因shRNA敲除慢病毒表达载体；

本发明的第三个目的是提供一种pirB病毒的制备方法。

本发明的第四个目的是提供抑制pirB表达的短发卡shRNA、pirB基因 shRNA敲除慢病毒表达载体以及pirB病毒的应用。

本发明所采用的第一种技术方案是，抑制pirB表达的短发卡shRNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的碱基序列。

本发明的第二种技术方案是，一种干扰质粒，该质粒含有上述的核苷酸序列。

本发明的第三种技术方案是，一种pirB基因shRNA敲除慢病毒表达载体，将上述的抑制pirB表达的短发卡shRNA插入慢病毒载体质粒 pGLVH3/H1/GFP+Puro所得。

以及重组上述的pirB慢病毒表达载体的构建方法，具体包括：合成用于编码pirB的核苷酸片段；用限制性内切酶用BamHI和EcoRI分别对上述的核苷酸片段和pGLVH3/H1/GFP+Puro载体进行双酶切；将双酶切后的所述核苷酸片段和pGLVH3/H1/GFP+Puro进行连接，得到重组的pirB慢病毒载体。