[发明专利]碱性磷酸酶活性的双通道检测方法

说明书

本发明提供了一种比色‑荧光双通道检测碱性磷酸酶活性的方法，包括如下步骤：利用碱性磷酸酶催化其底物L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐(AAP)水解，产生具有还原性的抗坏血酸(AA)，而AA能够将托伦试剂还原成Ag单质；在金纳米粒子(AuNPs)和石墨烯量子点(GQDs)存在的条件下，Ag将会沉积到AuNPs表面形成金银核壳纳米粒子(Au@AgNPs)并猝灭GQDs的荧光。本发明将酶促银离子金属化、AuNPs诱导银沉积与Au@AgNPs猝灭GQDs荧光相结合，利用颜色、紫外‑可见吸收光谱和荧光强度的变化，能够实现对碱性磷酸酶活性的比色‑荧光双通道检测。该方法具有灵敏度高、特异性强、响应快、操作简单、不需复杂仪器等特点。

技术领域

本发明涉及一种碱性磷酸酶活性的双通道检测方法，属于酶检测技术领域。

背景技术

碱性磷酸酶(ALP)是一种重要的生物标志物，其表达异常与乳腺癌、前列腺癌、骨病、糖尿病和肝脏功能障碍等多种疾病相关。血清中ALP的定量检测可辅助诊断相关疾病。光谱分析法由于简单、响应快等优势在ALP检测中得到了广泛应用。但是，基于单一材料、具有单一比色或荧光输出信号的常规光谱法抗干扰能力差、准确度低，难以用于复杂样品中目标物的检测。随着纳米科技的进步，已发展了多种基于纳米金和纳米银的ALP比色传感方法，但这类方法的灵敏度有待提高；核壳结构纳米粒子微弱的壳层改变即可引起显著的光谱和颜色变化，其出现为进一步提高比色检测的灵敏度提供了可能性。此外，与单一元素组成纳米粒子相比，核壳结构纳米粒子是更优异的纳米猝灭剂，将其与荧光材料结合可以构建双通道超灵敏酶生物传感器，赋予检测更高的准确性与多样性。中国专利CN104007080A公开了一种基于金纳米棒长银壳的碱性磷酸酶分析方法，该方法中的核壳纳米棒的波长可变性虽能提供丰富的颜色变化，却也因此使其难以与荧光材料相结合来构建多重信号传感体系。石墨烯量子点作为一种新型荧光碳材料，毒性低、稳定性高、且生物相容性好，在化学和生物传感中有广泛的应用前景。常规的非掺杂石墨烯量子点发光性能差、量子产率低，杂原子掺杂能有效调控其光学特征并提高荧光量子产率。中国专利CN106769959A公开了一种基于荧光和比色双重模式检测碱性磷酸酶活性的方法，该方法响应时间较长，比色检测灵敏度和可视化半定量检测的分辨率均较低。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种碱性磷酸酶活性的双通道检测方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种碱性磷酸酶活性的双通道检测方法，其包括如下步骤：

将柠檬酸和半胱氨酸混匀后，在240℃下反应后，溶解于超纯水中，在分子量为500的透析袋透析，得到氮硫掺杂的石墨烯量子点；

利用Turkevich-Frens方法制备粒径为13nm的金纳米粒子；

将所述石墨烯量子点、金纳米粒子和托伦试剂混匀后，得到检测液；

将Tris-HCl缓冲溶液、超纯水和L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐混匀后，均分成若干份，除一份不加碱性磷酸酶之外，其余分别加入不同已知浓度的碱性磷酸酶，均置于37℃下孵育；

孵育结束后，分别加入相同体积的所述检测液，室温下反应后，记录紫外-可见吸收光谱和激发波长为346nm下的荧光发射光谱，计算不同碱性磷酸酶活性对应的A₄₁₀/A₅₂₀值，以及1-F/F₀值，得到A₄₁₀/A₅₂₀及1-F/F₀与碱性磷酸酶活性之间的关系。

作为优选方案，所述金纳米粒子的制备方法为：

将氯金酸溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸钠溶液，至颜色为酒红色，继续搅拌反应后，得到金纳米粒子溶液，置于4℃下备用。