[发明专利]激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法

说明书

本发明涉及植物遗传育种技术领域，尤其涉及激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法。与现有技术相比，本发明通外植体的选择、遗传转化和再生体系的建立，能够迅速获得大规模的罗布麻突变体种子群体；该突变群体中激活标签序列(4个串联的35s增强子)激活标签随机分布于整个罗布麻基因组，增强其邻近基因的表达、诱发形成突变体，并且产生的突变体为显性突变，避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应。

技术领域

本发明涉及植物遗传育种技术领域，尤其涉及激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法。

背景技术

罗布麻(Apocynum venetum L.)，是夹竹桃科罗布麻属植物。别称红麻、茶叶花、红柳子等。我国对罗布麻植物的资源应用具有悠久的历史：罗布麻全株可入药，嫩叶蒸炒揉制后当茶叶饮用，有清凉去火，防止头晕和强心的功用。罗布麻的纤维具有有抗紫外线、抑菌、抗静电等保健功能，被誉为“野生纤维之王”，其茎皮纤维具有细长柔韧而有光泽耐腐耐磨耐拉的优质性能，为高级衣料、渔网丝、皮革线、高级用纸等原料，在国防工业、航空、航海、车胎帘布带、机器传动带、橡皮艇、高级雨衣等方面均有用途。叶含胶量达4-5％作轮胎原料。种毛白色绢质，可作填充物。麻秆剥皮后可作保暖建筑材料。根部含有生物碱供药用。罗布麻花多，美丽、芳香，花期较长，具有发达的蜜腺，是一种良好的蜜源植物。

罗布麻植株具有抗逆性强、再生性强，喜光、耐旱、耐碱、耐寒、耐贫瘠等特点，是荒漠化治理和荒漠区生态修复中首选植物。然而，多年来由于生长环境恶化，人为开垦、过度放牧等因素，资源量急剧减少，全国面积已经不足50年前的十分之一。解决罗布麻供需矛盾，创制优异罗布麻新种质，减少人们对野生资源依赖，具有极其重要的意义。

罗布麻组织培养和再生体系研究取得的系列进展，很大程度上促进了罗布麻重要农艺性状基因的挖掘与研究。但与其他作物相比，在无论是外源基因、受体材料，还是遗传转化方法上都仍有较大差距，传统的杂交或是组培再生的方法很难快速、高效地获得大量突变体。

罗布麻种子小、结子量大，采用花蕾浸染转化的方法，利用罗布麻茎的柔韧性直接进行花器官浸染，成熟期便可获得大量的诱变种子，避免了大量繁重的组培转化工作，适用于大规模突变体库的构建。

此外，相对于传统的化学、物理诱变法，通过激活标签技术来激活或增强邻近基因的转录来诱发植物基因突变，构建突变体构建具有如下优点：(1)激活标签法诱导产生显性突变，在T1代即可观察到可见的表型改变；(2)避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应；(3)适用于对基因家族或是遗传丰余基因成员进行功能验证。激活标签的插入热点大多集中在基因组的活跃转录或具有转录潜力的区域，是理想的基因标记工具。随着植物转化技术的不断完善，在棉花、烟草、盐芥等许多重要的一年生经济作物中已经成功建立了激活突变文库，但在罗布麻等多年生宿根型草本作物中仍未有相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供激活标签载体与罗布麻种子突变体库的构建方法，该构建方法转化率高。

本发明提供了包含4×35S增强子和GUS报告基因的质粒载体。

4×35S增强子是4个串联的35S增强子，其作为激活标签序列，随机分布于整个罗布麻基因组，增强其邻近基因的表达、诱发形成突变体，并且产生的突变体为显性突变，避免了因功能丧失型突变而产生的致死效应。而GUS报告基因能够用于瞬时转移检测。

本发明提供的质粒载体的骨架载体为pSKI074载体。

所述4×35S增强子的插入位点是BssS I与BamH I双酶切位点；所述GUS报告基因的插入位点是Not I与Kpn I双酶切位点。

本发明所述质粒载体的构建方法：利用多步酶切连接反应，在pSKI074载体中引入GUS报告基因和4×35S增强子。

本发明还提供了转染包含4×35S增强子和GUS报告基因的质粒载体的农杆菌。