[发明专利]一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用

说明书

本发明公开了一种一种诱导干细胞分化为神经元的方法及神经元与应用，利用目的基因mRNA转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mRNA诱导神经元。该方法利用了人诱导性多能干细胞iPSCs的生物学特性，通过脂质体转染mRNA表达促神经元分化的转录因子，从而实现干细胞体外定向分化为神经元。该方法为神经元损伤缺失后的补充来源提供了保障，也为用干细胞移植替代临床治疗神经退行性疾病，如帕金森病、阿尔茨海默疾病和脑缺血损伤等疾病奠定了基础。本发明将在医学领域发挥重要作用，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及干细胞分化技术领域，特别是涉及一种诱导干细胞分化为神经元的方法，尤其是，一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经元(dopaminergic neuron)，胆碱能神经元神经元(cholinergic neuron)，γ-氨基丁酸能神经元(GABAergic neuron)，谷氨酸能神经元(glutaminergic neuron)等多种类型神经元的快速高效的方法，及由该方法获得的神经元，目的基因mRNA在诱导干细胞分化为神经元的诱导剂中的应用。

背景技术

多能干细胞(PSCs)具有独特的自我更新能力和多系分化潜能，包括诱导性多能干细胞(iPSCs)。人类PSCs，特别是来源于疾病患者的iPSCs，在组织再生医学中的有着多种应用，包括疾病模型的建立，新型治疗药物的研发以及细胞替代疗法的开发，具有广阔的临床前景。iPSCs在再生医学中的应用很大程度上依赖于高效的分化技术，即建立快速有效的方法将其诱导分化成特殊种系和功能完整的后代(例如:各种神经元亚型)。

目前，高效分化iPSCs的方法包括基于化合物的iPSC分化、使用慢病毒产生基因整合等。然而，基于化合物的iPSC分化相对缓慢且稳定性差；使用慢病毒产生基因整合的方法目前在临床转化方面仍然存在安全隐患，实际操作性不理想。

因此，一种能够高效分化iPSCs的方法是本领域的研发方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，第一方面，提供一种快速高效的诱导人干细胞分化为神经元的方法，利用目的基因mRNA转染干细胞后，诱导干细胞分化，得到神经元，称为mRNA诱导神经元；所述神经元为多巴胺能神经元(dopaminergicneuron)、胆碱能神经元神经元(cholinergic neuron)、γ-氨基丁酸能神经元(GABAergicneuron)或谷氨酸能神经元(glutaminergic neuron)。

所述干细胞选自人诱导性多能干细胞或神经干细胞。

所述人诱导性多能干细胞可以是通过重编程的方式将来源于皮肤的成纤维细胞、人全血PBMC、或分离自尿液的肾上皮细胞等细胞制备得到的人诱导性多能干细胞。

所述目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA。

包括以下步骤：

1)体外合成目的基因mRNA，目的基因mRNA可以选自编码NEUROD1、NEUROG1、NEUROG2、ASCL1、或ATOH1等蛋白质的mRNA；

2)将步骤1)获得的目的基因mRNA和干细胞置于培养基中转染，同时干细胞于培养基中培养进行分化(所述分化过程培养基优选用mTeSR^TM 1试剂盒或StemFlex^TM Medium试剂盒)；

3)至干细胞出现神经元祖细胞形态且可检测出神经元标记物TUJ1时，进行神经元祖细胞传代，挑选贴壁附着的细胞，即得到mRNA诱导神经元(简称miN)；

优选的，步骤2)具体为：