[发明专利]一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种来源于海洋细菌的褐藻胶裂解酶（Alg509）及其基因。同时还公开了重组表达和制备该褐藻胶裂解酶的方法，即将alg509基因克隆到大肠杆菌表达载体上，并将该载体转化大肠杆菌宿主菌，获得可异源表达该酶的重组工程菌株。本发明公开的褐藻胶裂解酶Alg509酶活高，比酶活可达48000U/mg以上，其最适反应pH为10，最适反应温度为55℃，且酶活对各种金属离子没有依赖性。该酶对海藻酸钠、多聚古洛糖醛酸（polyG）、多聚甘露糖醛酸（polyM）均有活性，能将海藻酸钠彻底降解，产生褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖等褐藻寡糖。该酶表现出较强嗜碱性，对高pH具有一定耐受力，具备一定工业应用的潜质，可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药等领域。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种褐藻胶裂解酶及其编码基因、其制备方法及应用。

背景技术

我国海藻资源丰富，近几年随着海洋药物的不断发展，海藻多糖的研究日益受到重视，而褐藻便是具有广泛应用价值的海藻之一，代表植物包括海带、鹿角菜和马尾菜等。它也是海洋中含量丰富的经济类海藻植物，它含有褐藻胶(algin)、褐藻糖胶(fucoidan)及海带淀粉(laminaran)等多种多糖。目前市场上的褐藻酸钠(商品名为海藻酸钠)或其他褐藻酸盐主要是从褐藻中获得。

褐藻胶是由α-L-古罗糖醛酸(Guluronic acid,G)和β-D-甘露糖醛酸(Mannuronicacid,M)两种糖单元通过糖苷键链接而成的线性多糖，分子内聚M段、聚G段和M/G混合段交替排列。研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有有多种生物活性，比如免疫调节、促生长、诱导植物抗性、提高蛋白质稳定性和促进肠道内双歧杆菌生长等，最新研究表明：用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物“971”能抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，正用于抗阿尔兹海默症的二期临床研究；聚G寡糖可与抗生素协同抑制临床多耐药致病菌。因此，组成特殊、聚合度特定的褐藻胶寡糖具有重要应用价值和经济价值，实现这类寡糖的高效制备具有重要意义。

褐藻酸钠可用多种方法降解，包括化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法以酸降解为主，但该方法降解条件难以控制，操作较复杂，耗时长。物理降解法包括辐射法和超声法等，与化学、物理降解法相比，褐藻胶的酶法降解具有条件温和、易控制，且底物选择性强等特征，因而具有推广应用的潜质。褐藻胶裂解酶属于多糖裂解酶家族成员，能够催化糖醛酸单元之间的1，4糖苷键发生水解，在断裂后新形成的非还原端生成双键。按照其底物特异性的差异，褐藻胶裂解酶可以分为三类：专一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)、专一性降解聚古罗糖醛酸的聚古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)和能降解上述两种片段的双功能褐藻胶裂解酶。因其具有专一、高效及反应温和等优点，且能为后续研究寡糖化学结构提供信息，故而褐藻胶裂解酶逐步成为优先降解褐藻酸钠的方法。此外，褐藻胶裂解酶可以作为工具酶用于褐藻胶精细结构的分析，海藻单细胞及原生质体的制备，治疗囊性纤维化(CF)患者的肺部感染及生产生物燃料等。

在自然界中能够产生褐藻胶裂解酶的生物分布广泛，已报到产褐藻胶裂解酶的物种有海洋软体动物、棘皮动物、细菌、真菌等,其中对细菌产褐藻胶裂解酶的研究最多。目前获得褐藻胶裂解酶大多数是专一性降解聚甘露糖醛酸的褐藻胶裂解酶，少数是具有降解古洛糖醛酸活性的褐藻胶裂解酶，而具有广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶则非常稀少，只有来源于Pseudoalteromonassp.的褐藻胶裂解酶Aly-SJ02(李建伟,Marine Drugs,2011,21:1374-80)，来源于白蚁肠道的Isoptericola halotolerans的褐藻胶裂解酶AlyIH(窦文芳等,Carbohydrate Polymers,2013,98:1476-82)等具有广泛底物特异性，但酶活力较低，而且稳定性差，其中AlyIH只是获得了纯化的酶，尚未获得其编码基因，不能进行重组表达和分子改造；而且大多数褐藻胶裂解酶活性较低。因此，筛选酶活力高、稳定性强的褐藻胶裂解酶，构建产酶量高的工程菌株具有重要意义。

发明内容