[发明专利]一种培育生产低致敏性牛奶的牛的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种培育生产低致敏性牛奶的牛的方法及其应用。该方法包括如下步骤：向牛成纤维细胞导入锌指核酸酶载体pZFN，得到基因型为双等位基因突变型的供体细胞；双等位基因突变型为牛的两条同源染色体上的β‑LG基因的核苷酸分子均发生移码突变；将供体细胞的细胞核移入除去细胞核的牛卵母细胞，发育形成重构胚胎，然后移入母牛子宫，分娩获得生产低致敏性牛奶的牛。本发明成功培育了无外源DNA整合、可产生无β‑乳球蛋白牛奶和通过正常育种将突变传递给下一代的β‑LG双等位基因敲除牛。本发明为解决牛奶过敏问题打下重要基础，同时也将为人源化牛奶的制备提供无限可能。本发明具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种培育生产低致敏性牛奶的牛的方法及其应用。

背景技术

牛奶是世界性食用的一种重要的营养非常均衡的健康食品，包括丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪素和矿物质。虽然通过多年的育种策略，营养管理和数量遗传学提高了牛奶的产量，但是，牛奶的成分没有获得显著变化。随着生物技术和基因工程的发展，特别对畜牧业品种改良提供了更大的机会来制备适合人类的“设计型牛奶”。截止目前，各种高品质转基因牛已经报道，例如表达重组人乳铁蛋白牛、增加牛奶酪蛋白含量牛、抗乳房炎的牛、抗疯牛病的牛、提高动物福利的无角牛。但是，牛奶的过敏反应问题目前还是不能很好地解决。

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-LG)是牛奶当中的主要过敏原，牛乳过敏在婴幼儿食物过敏中最为常见。国外流行病学调查结果显示，婴幼儿牛乳蛋白过敏的发病率为0.3％-3.5％，且有不断上升的趋势，严重影响婴幼儿对乳制品中营养物质的吸收利用。迄今为止，研究人员已经尝试多种技术来降低牛乳中β-LG的致敏性，主要包括热处理法、高压法、酶解法和糖基化改性法等等。虽然这些方法在一定程度上降低了β-LG的致敏性，但牛奶中其它蛋白的结构和功能遭到了破坏，牛奶的营养作用大大降低，β-LG的致敏性也并不能完全消除。如何有效的降低β-LG致敏性，同时又尽可能保持蛋白原有的结构和功能，目前国内外都没有有效可行的技术方法。

2001年，Bibikova等人首次在非洲爪蟾卵母细胞内利用锌指核酸酶成功介导同源重组，锌指核酸酶技术引起生物领域的广泛重视，在动物和植物中广泛应用于基因的删除、修复、大片段DNA删除以及基因的定点插入等。锌指核酸酶介导的高效率基因打靶技术已经与人类疾病治疗相结合，由美国Sigma公司设计的锌指核酸酶已经成功完成一期临床实验，结果令人振奋。他们通过基因工程的方式制定特异结合人类CCR5基因的锌指核酸酶(HIV病毒利用CCR5基因编码蛋白，侵染人的CD4+细胞)，使得该基因失活，从而抵抗HIV病毒的侵染。通过HIV病人注入锌指核酸酶修饰过的CD4+细胞(CCR5基因敲除)，接受治疗的6位HIV病人中，有5位的免疫细胞数量显著上升。Urnov等人利用锌指核酸酶介导IL2Rγ基因的修复(免疫缺陷疾病)，可以修复细胞的突变IL2Rγ基因(效率高达18％)，从而恢复该基因表达，表现为有免疫性能的T细胞，为免疫缺陷性病人提供了一个很好的治疗途径。Hockemeyer等人在人类干细胞中利用锌指核酸酶修饰OCT4和PITX3基因，证明了锌指核酸酶可以在干细胞中高效作用于不同表达水平的基因，为干细胞治疗奠定了一定基础。锌指核酸酶介导的高效率基因打靶技术已经和体细胞克隆技术相结合，Whyte等人已经获得利用锌指核酸酶介导GFP基因敲除的克隆猪，基因敲除效率高达5％。此外，我国学者赖良学教授领导的科研团队也成功利用锌指核酸酶介导猪的PPAR-γ基因敲除，获得相应的基因敲除克隆猪。

发明内容

本发明的目的是生产低致敏性牛奶或培育生产低致敏性牛奶的牛。

本发明首先保护培育生产低致敏性牛奶的牛的方法。

本发明要保护的培育生产低致敏性牛奶的牛的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：抑制出发牛基因组中β-LG蛋白的合成和/或表达量和/或活性，得到转基因牛；与出发牛相比，转基因牛生产的牛奶致敏性降低。