[发明专利]一种DNA-Maker的简易制备方法

权利要求书

1.一种DNA-Maker的简易制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、构建重组质粒载体；

步骤2、对重组质粒载体进行基因工程改造；

步骤3、重组质粒的提取；

步骤4、重组质粒质粒酶切；

步骤5、酶切产物的纯化回收；

步骤6、纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的构建重组质粒载体具体为：以pPIC9k载体为模板，设计7条引物，在上游设计一条公共引物，在下游分别设计5条引物，在上游引物设计两个酶切位点，两个酶切位点分别为GAATTC和CTCGAT，在下游引物上设计一个酶切位点，酶切位点为GTCGAC，且设计为同尾酶酶切位点，使PCR产物经内切酶切割后产生相同的粘性末端，便于克隆到载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2- SEQ ID NO.6所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的对重组质粒载体进行基因工程改造具体为：质粒载体pPIC9k用BamH I酶切后，对质粒载体去磷酸化处理,然后用XholI和SaⅡ双酶切片段后与载体质粒相连接；将连接产物转化的大肠杆菌 JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养；挑取若干白色单菌落置含Amp的 LB培养液中37℃振摇过夜培养，用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I 酶切及电泳分析鉴定；鉴定得到的重组子再次用 XholI 酶切后,对重组子进行去磷酸化处理，然后再与用XholI和SaⅡ双酶切后的另一个片段相连接，将新连接产物转化的大肠杆菌JM109在含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂培养基中筛选培养,挑取若干单菌落置含Amp的LB培养液中37℃振摇过夜培养,运用菌体电泳的方法筛选出滞后菌落,用试剂盒提取质粒DNA进行EcoR I酶切及电泳分析鉴定选出新的重组子；如此反复进行酶切、去磷酸化、连接、转化、筛选、再酶切验证直到最后一个片段连接上载体构成含多个 EcoR I 酶切位点的 DNA-Maker 载体。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的重组质粒质粒酶切，为完全酶切，即100ul完全酶切体系为：质粒70ul、Cutsmart buffer 10ul、EcoR Ⅰ 5ul、ddH₂O15ul，酶切时间为8个小时。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤5中的纯化回收产物与储存液、Loading buffer混合储存具体为：纯化回收的DNA-Maker用EB 溶解后，加5%甘油、总体积十分之一的10ⅩLoading buffer，混匀后放在-20℃冰箱即长期保存。