[发明专利]一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法

说明书

本发明涉及一种应用Cas9技术制备CKO/KI动物模型的方法。该方法采用体外表达纯化的Cas9蛋白、预先用胚胎进行sgRNA切割效率测试筛选出的高效率sgRNA、以及单链DNA作为打靶载体，将三者混合后进行胚胎注射及移植；移植后生出的小鼠标记为F0，将F0进行基因型鉴定，对已经性成熟且基因型鉴定正确的F0进行配繁，其后代小鼠标记为F1，对F1小鼠进行分析验证，基因型验证正确的F1小鼠即为制备的CKO/KI动物模型。本发明方法流程完善，可以同期开展多项技术服务，满足不同定制化需求，解决了Cas9‐mRNA质量较难控制、sgRNA体内切割效率未知、双链打靶载体随机插入等问题，降低了实验成本。

技术领域

本发明涉及一种Cas9技术应用于动物模型的制备方法，特别是一种CKO/KI动物模型的制备方法。

背景技术

CKO/KI动物模型一直以来是研究基因功能、筛选药物的重要工具。但是传统的制作方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。

CRISPR/Cas9是2013年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。在这一系统中，crRNA(CRISPR‐derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans‐activating RNA)结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA，产生双链断裂(DSB：Double‐strand break)，细胞通过非同源或同源末端连接(NHEJ：nonhomologous DNA end joining；HR,homology‐directed repair)的方式对断裂的双链进行修复，从而实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等。

CRISPR/Cas9技术是继锌指核酸酶(ZFN)、ES细胞打靶和TALEN等技术后可用于定点构建基因修饰动物的第四种方法，且有效率高、速度快、简单经济及生殖系转移能力强等特点，在动物模型构建的应用前景非常广阔。

目前国内、外各实验室和公司在使用CRISPR/Cas9技术时，一般通过体外转录的Cas9‐mRNA转入胚胎内表达Cas9蛋白，但体外转录的Cas9‐mRNA在胚胎内的蛋白表达效率受体外转录的mRNA质量影响，进而影响打靶效率。除此之外，打靶效率也受sgRNA切割效率高低的影响，而网站预测的sgRNA活性评分并不能反映出sgRNA在胚胎内的真实切割效率。另外，CRISPR/Cas9技术所伴随的双链打靶载体随机插入问题也是不可忽略的，不过，大量的研究表明，以单链DNA为修复模板的模式可以降低随机插入率。

这一流程存在的Cas9‐mRNA质量较难控制、sgRNA体内切割效率未知、双链打靶载体随机插入的问题，则增加了实验成本和时间，限制了技术的广泛应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明将Cas9‐mRNA替换为体外表达纯化的Cas9蛋白，可一次制备获得大量Cas9蛋白，通过活性切割的蛋白即可应用于生产；同时，为了保证项目成功率，先用胚胎进行sgRNA切割效率的测试，筛选出高效率的sgRNA。另外，我们使用单链DNA作为打靶载体，很大程度上降低了随机插入率。

本发明旨在利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术，以体外表达获得的蛋白和通过胚胎筛选获得的高效sgRNA组合，实现基因组多位点打靶，对靶基因上的多个位点实行剪切，实现基因组改造的目的。