[发明专利]研究离体百合植株同化物运输方向和路径的荧光示踪方法

说明书

本发明涉及植物细胞生理学研究技术，旨在提供一种研究离体百合植株同化物运输方向和路径的荧光示踪方法。包括：在离体百合鳞茎的外层鳞片切口或叶片维管束横断面敷以浸润了CFDA溶液的医用药棉，以石蜡封口膜包裹后，用锡箔纸覆盖；再以原培养条件继续培养72h；在拟观察部位徒手切片取样，用荧光显微镜观察CF在切片内的分布图像并拍照。本发明采用的荧光染料CFDA对细胞无毒、化学惰性，且量子产率比较高，在尽量不损害卸载机制的情况下，可从活细胞水平适时追踪不同发育时期百合鳞茎内同化物的运输方向和路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。不需样品的特殊处理、成本低廉，可快速、有效地获得理想的标记结果。

技术领域

本发明涉及植物细胞生理学研究技术，尤其涉及一种基于离体模式体系的百合小鳞茎发育过程中同化物运输方向和路径的荧光示踪方法。

背景技术

百合被誉为“球根花卉之王”，是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)所有种、亚种、变种、变型及品种的统称。百合以观花为主，是世界五大鲜切花之一。百合不仅可以观花，其鳞茎含丰富的淀粉，部分品种可供食用或药用，也可提取香料，应用价值广泛。球根花卉种球自然繁殖率较低，童期长，因此新品种育种周期较长，例如，百合约12～15年，郁金香约20～30年。球根类植物的健壮生长与地下储藏器官的大小直接相关，百合的地下部分--鳞茎有着极大的研究及开发价值。

“源”通常指植物体内能产生碳水化合物的光合组织，如叶片，茎等；“库”主要为碳水化合物的积累和使用组织，碳水化合物用于生长、贮藏和呼吸作用等包括快速生长的组织、地下贮藏器官、根、遮阴状态下或老的叶片等。离体体系下，碳水化合物的“源”包括来自叶的光合产物及培养基中的蔗糖成分，经韧皮部运输进入鳞茎贮藏或进一步利用，不仅成为百合鳞茎品质和其他营养成分合成的基础原料，而且可作为重要的信号分子参与鳞茎发育过程相关基因的表达、鳞茎“源-库”角色的转换以及整个植物源-库活性的调节。高等植物中，物质运输主要在维管束中进行，韧皮部则是负责同化物在体内运输的主要组织。百合鳞茎“源-库”角色转化过程中，韧皮部同化物运输途径主要有共质体途径(symplastic)和质外体途径(apoplastic)。共质体途径是通过胞间连丝进行的，质外体途径则是跨膜运动，需要特定的载体和以及能量的驱动。百合鳞茎与以往所研究的单独作为“源”，如成熟叶片，和单独作为“库”如发育的果实不同，前者只存在同化物的装载和运出过程，后者则只存在同化物的卸载、积累和再利用等过程。百合鳞茎作为多年生的“源-库”复合体，在其生长发育过程中会经历多次“源-库”角色的转换，转换过程中碳水化合物的代谢对于植物的生长及开花的品质具有重要的作用，因此探明百合鳞茎源库转化过程中同化物运输方向及路径对于促进鳞茎内糖的积累和转化，对于优质百合鳞茎和切花都具有重要的理论意义和实践价值。

百合鳞片由表皮、薄壁组织、维管束和初生分生组织构成，在薄壁组织内分布着的维管束与表皮平行排列成1排，并且鳞片中部维管束大且分布稀疏，至两边维管束变小且分布密集，这些维管束源源不断地为百合鳞茎的生长发育提供必需的物质。羧基荧光素(Carboxyfluoreseein)，简称CF，是5-和6-羧基代替的荧光素混合物，通常以酯类或以弱酸的形式进行装载；例如5(6)羧基荧光素酯，5(6)-carboxyfluoresein diacetate(缩写CFDA，市售商品)。当不具有荧光的膜透过性CFDA进入细胞后，便分解成膜不透过性荧光染料5(6)-CF，因而只能通过胞间连丝等共质体途径在细胞和组织间进行转运，因此被广泛用作共质体转运标记的探针，主要用于标记细胞间转运，细胞融合，及茎和叶中共质体的连续性等方面的研究。5(6)-CF已被广泛用来作为研究植物体内韧皮部共质体卸载和韧皮部转运的荧光指示剂，目前己在核桃、葡萄，苹果，梨、等果实中研究了果实发育过程中同化物由源-叶，运输到库-果实中的路径和卸载，同时还用CF研究了大麦和烟草库叶中韧皮部共质体卸载路径，微繁组培作为多种植物尤其是百合，生产和常用体系，但离体百合鳞茎CFDA荧光染色还未有报道。通过在荧光显微镜下观察CF在植株内的分布情况，就可以了解植物体内同化物运输路径，比传统的显微放射自显影技术更安全、更简单。