[发明专利]一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用

说明书

本发明公开了一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用。本发明所提供的直接PCR扩增方法是将甘蓝种子发芽4‑5天后取下胚轴直接作为模板，采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法。本发明所提供的直接PCR扩增方法简单、快速、实用性强，获得的PCR检测结果准确、灵敏度高、特异性强，并且与传统的将种子发芽后取幼嫩叶片进行DNA的提取和PCR检测的方法相比，避免了提取DNA的繁杂步骤，大大地减少了检测成本和检测时间。本发明在甘蓝“苏甘20”杂交种遗传纯度鉴定方面具有很大的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种直接PCR法及其在甘蓝杂交种遗传育种中的应用。

背景技术

结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)简称甘蓝，属于十字花科芸薹属甘蓝种中顶芽能形成叶球的变种，是我国重要的十字花科蔬菜之一。其营养丰富，适应性及抗逆性均较强，全国各地普遍种植，在蔬菜供应中具有举足轻重的地位。

目前，生产中推广的甘蓝品种大多数是杂交种，杂交种的生产主要是利用雄性不育系和自交不亲和系制种。但是在其制种过程中，常常由于雄性不育系能产生少量花粉以及自交不亲和系亲和指数的问题会导致母本自交产生的假杂种常混杂于F_l中，降低了种子的质量和纯度，进而给生产带来不必要的损失。因此，在杂交种用于销售和生产之前，对杂交种遗传纯度的鉴定是及其重要的。目前，杂交种真实性及纯度的鉴定方法主要有田间形态鉴定法、生化标记鉴定法和DNA分子标记鉴定法。田间形态鉴定法不仅鉴定周期长，还易受外界环境以及检测人员主观判断的影响，难以满足大规模种子纯度鉴定以及当年生产需要(石星星,纪小红,张磊,等.利用SSR标记鉴定结球甘蓝杂交种真实性及纯度.分子植物育种,2015,13(2):331-337)。生化标记鉴定法如同工酶电泳和蛋白质电泳技术其稳定性差且位点的多态性较低，难以用于杂种纯度的检测和品种鉴定。而DNA分子标记鉴定法不仅数量多、准确、快速且不受季节环境限制，已广泛应用于作物种子纯度鉴定(袁天成,司军,宋洪元,等.结球甘蓝西园六号种子纯度的SSR和SRAP鉴定.西南大学学报:自然科学版,2014,36(6):41-46)。插入缺失多态性标记(Insertion-deletion polymorphism,InDel)是在等位基因位点上一定数量的核苷酸插入或缺失而产生的长度多态性变异，是基于全基因组序列的新一代分子标记，因其在基因组中的高密度分布，具有标记特异性高、稳定性好、检测方法简单、经济等优点，目前成为甘蓝杂交种纯度鉴定的首选技术之一(朱东旭,王彦华,赵建军,等.结球甘蓝相对于大白菜连锁群特异InDel标记的建立及应用.园艺学报,2014,41(8):1699-1700)。

进行常规PCR法中制备DNA模板不仅是检测的第一步，也是保证检测结果准确与否的基础。目前主要使用CTAB法和SDS法等方法从待测样品中提取DNA作为PCR反应的模板。但DNA提取的方法操作复杂，提取时间较长，同时提取液中含有的苯酚、氯仿和异戊醇等试剂易对环境造成污染。在大规模的杂交种子纯度鉴定中，DNA模板的提取己成为检测环节中花费人力、物力和财力最多的一个环节。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种直接PCR法。

本发明的另一目的是提供该方法在甘蓝“苏甘20”杂交种遗传育种中的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种直接PCR法，该方法是将甘蓝下胚轴直接作为模板，采用预混抗Taq DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶通过热启动法进行PCR扩增的方法。

在所述方法中，所述下胚轴优选甘蓝种子发芽4-5天后的下胚轴。

为了达到更加理想的PCR效果，在本发明的一个实施例中，所述在直接PCR反应体系中的下胚轴优选以截取一段长度为1-1.5mm的下胚轴的形式存在的。