[发明专利]一种提高灵芝细胞中单体灵芝酸含量的方法

说明书

本发明公开了一种提高灵芝细胞中单体灵芝酸含量的方法，其是将灵芝菌株活化后接种到含有玻璃珠的液体种子培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种到添加了硅酸镁颗粒或氧化铝颗粒的发酵培养基中，在24‑30℃下恒温振荡培养，实现提高灵芝细胞中单体灵芝酸含量的目的；本发明的方法能够使灵芝细胞中GA‑Mk，GA‑T，GA‑S，GA‑Me的含量提高，且方法简单，易操作，适于工业化生产和市场推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种通过添加微颗粒提高振荡培养灵芝细胞中单体灵芝酸含量的方法。

背景技术

灵芝（Ganoderma lucidum）是一种高等真菌，作为一种传统中药已经有了数千年的药用历史。现代药理学研究表明灵芝具有广泛的药理作用，比如抗HIV病毒、抗缺氧和抗衰老作用、调节血脂、降血糖、镇静作用、保肝作用等等。灵芝含有多种活性物质：多糖、三萜类物质、生物碱氨基酸多肽等；灵芝酸作为一种重要的三萜类化合物，具有抗HIV病毒、抗转移、抗肿瘤等的作用；不同的单体灵芝酸也表现出不同的药理活性，比如灵芝酸T具有诱导肺癌细胞凋亡活性（Tang W，et al.Life Sciences，2006；80，205-211），而灵芝酸Me具有抑制肿瘤扩散（Chen NH，et al. Journal of Pharmacological Sciences，2008；108，212-216）和增强IL-2和IFN-γ表达以及增加NK细胞活性（Wang G，et al.InternationalImmunopharmacology，2007；7，864-870）。灵芝酸S对癌细胞的增殖和侵袭具有抑制作用（Liu RM，et al. Phytomedicine, 2011；18，349-355；Tang W，et al. Life Sciences，2006；80，205-211）灵芝酸Mk可通过线粒体途径抑制HeLa细胞的增殖并诱导细胞凋亡（LiuR M，et al. Latin American Journal of Pharmacy，2012；31 ，43-50）。灵芝酸在细胞中的低含量以及其分离纯化的难度严重限制了它的广泛应用及其作用机理的进一步研究。

经对现有技术的文献检索发现，中国发明专利申请公开说明书CN103392510A中公开了在两阶段液体摇瓶发酵过程中的第二阶段添加乙酸来提高灵芝酸含量的方法，相比对照提高了27.6%-156.2%。中国发明专利申请公开说明书CN101692772A中提供了一种液体摇瓶培养和液体静置培养并在静置培养中添加苯巴比妥或咪康唑来提高灵芝酸含量的方法，此方法使单体灵芝酸的含量提高了15%-60%；但通过添加微米级微颗粒来提高单体灵芝酸的方法尚未见报道。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供了一种通过添加微颗粒提高灵芝细胞中单体灵芝酸含量的方法；本发明方法是将灵芝菌株活化后接种到含有玻璃珠的液体种子培养基中进行培养，获得种子液，将种子液接种到添加了硅酸镁颗粒或氧化铝颗粒的发酵培养基中，在24-30℃下恒温振荡培养，实现提高灵芝细胞中灵芝酸含量的目的；通过本发明方法使得灵芝细胞中GA-Mk、GA-T、GA-S、GA-Me的含量最高为对照的3.3、11.6、9.37、14.8倍。

所述硅酸镁在发酵培养基中的终浓度n为0＜n＜20 g/L，氧化铝在发酵培养基中的终浓度m为0＜m＜20 g/L。

所述硅酸镁颗粒或氧化铝颗粒的粒径为5-50μm。

所述玻璃珠的粒径为5mm。

所述种子液的添加量为发酵培养基体积的6%。

本发明方法包括以下步骤：

（1）土豆培养基斜面上培养灵芝菌丝体

土豆培养基的配方：每升汁液（添加200g去皮土豆煮沸30 min获得）、葡萄糖10g、无水硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾3g、维生素B₁ 0.05g、琼脂20g，pH为5.5。