[发明专利]一种高效形貌无损的外泌体分离方法

说明书

本发明涉及高效形貌无损的外泌体分离方法，可有效解决现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题，其解决的技术方案是，具体包括以下步骤：a、制备核酸适配体修饰的用于识别捕获外泌体的磁珠；b、样品的选择和前处理；c、利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本；d、利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体；本发明外泌体分离方法有效解决了现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题，可高效得到形貌无损的外泌体，是外泌体分离方法上的创新。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种高效形貌无损的外泌体分离方法。

背景技术

外泌体是由活细胞分泌的，直径为30nm～150nm的囊泡。研究表明，外泌体携带有丰富的生物学信息，包括蛋白质、mRNA和microRNA等物质，在细胞交流中起着至关重要的作用。此外外泌体还参与调控机体生理病理过程，越来越多的研究表明，外泌体参与形成肿瘤的前病灶，在肿瘤的发生发展和转移过程直接相关。因此外泌体对于癌症的临床检测与治疗具有重大意义。当前外泌体研究仍处于初级阶段，面临的首要问题仍是如何高效无损地分离外泌体。

目前的外泌体提取方法如超高速离心法、试剂盒沉淀法、免疫共沉淀法等有着不容忽视的缺点，如耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度等，一些方法更是面临如何将捕获的外泌体释放的难题。因此，现有的外泌体分离技术不能满足该领域研究需求，开拓新的外泌体分离方法势在必行。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种高效形貌无损的外泌体分离方法，可有效解决现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题。

本发明解决的技术方案是，具体包括以下步骤：

a、制备核酸适配体修饰的用于识别捕获外泌体的磁珠：方法是，利用末端修饰有生物素的核酸适配体与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系共孵育，在反应体系中，磁珠浓度为1×10⁸ - 1×10⁹个/ml，核酸适配体浓度20 - 500nM，在37℃水浴中共孵育10 - 30min，孵育完成后利用圆环磁铁进行磁分离，用pH值为7.4的PBS缓冲液洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的核酸适配体，得到修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体的磁珠；

b、样品的选择和前处理：样品来源为人体液的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液，其中，细胞培养液前处理：将细胞培养液以1000 r/min 速度离心8-10 min除去死细胞，将所得上清液过0.22μm滤膜，除去细胞碎片后待用；血液、唾液、乳液、尿液样品的处理均为：将收集的样品于3-5℃、3000r/min离心8-10min，取上清液过0.22 μm滤膜后待用；

c、利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本：将步骤a中得到的修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体的磁珠与步骤b中处理后的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液样品的其中一种置于样品管中，37℃共孵育0.5-1h，孵育完成后，将样品管置于圆环磁铁上静止3-5min沉淀，弃去上清液，用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤沉淀两次，得外泌体样本；

d、利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体：将c步骤中得到的外泌体样本重新分散于pH值为7.4的PBS缓冲液中，加入核酸适配体的完全互补链，使得核酸适配体完全互补链终浓度为1-1.5μM，于37℃共孵育0.5-1h，将孵育后的样品管置于磁力架上静止3-5min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌无损的外泌体。

本发明外泌体分离方法有效解决了现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题，可高效得到形貌无损的外泌体，是外泌体分离方法上的创新。

附图说明

图1为本发明表面修饰有核酸适配体的磁珠识别捕获外泌体，并通过核酸适配体完全互补链替换释放出捕获的外泌体示意图。