[发明专利]一种用于捕获血液中外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于捕获血液中外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）将六水合氯化二铁和四水合氯化亚铁混合后溶于蒸馏水中，搅拌混匀后加热至70℃，然后缓慢滴加氨水溶液，水解基本完成后，向溶液缓慢加入溴化十六烷基三甲胺，搅拌离心收集产物洗涤，取下层沉淀真空干燥得到纳米Fe₃O₄粒子；（2）取纳米Fe₃O₄粒子分散在由乙醇水溶液中超声处理后，加入原硅酸四乙酯溶液后，逐渐加入氨水水浴中反应5 h，离心收集产物，洗涤干燥即为包裹了SiO₂且表面分布孔径为40‑200 nm的不规则的磁性微纳米颗粒，优点是最大程度无损结合外泌体，且使用的样本量少，处理时间短，操作简便。

技术领域

本发明属于肿瘤检测领域，尤其是涉及一种用于捕获血液中外泌体的磁性纳米颗粒的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，由于环境及生活方式的改变，我国恶性肿瘤（亦称癌症）的发病率明显升高。与此同时，我国因恶性肿瘤死亡的人数也不断增加，造成这一现象很大部分归因于多数患者在明确诊断时已到了癌症的中晚期，失去最佳治疗时机。晚期的癌症患者在治疗后的存活率极低，且存活时间短，而早期癌症患者的治愈率高，约有80%-90%。因此，早期诊断对于癌症诊治显得格外重要。目前，恶性肿瘤的诊断方法包括内镜（EUS、PPS）、影像学检查（B超、CT、MRI、MRCP、PET、PIDUS，等）和循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）诊断等。但由于部分恶性肿瘤的位置隐匿，内镜及影像学技术的识别范围有限，导致诊断效果不精确。此外，一些传统医学手段和某些有创的检测方法如逆行胰胆管造影（endoscopicretrograde cannulation of the pancreatic，ERCP）都存在其固有的缺陷，极有可能造成并发症。因此，目前非常有必要寻找能够弥补现有诊断方法的新型、灵敏并且应用方便的检测方法以及相应的标志物。

细胞的外泌体（exosome）检测可能给癌症的早期诊断带来新的希望。外泌体是细胞主动分泌的小囊泡，起源于内涵体，直径约为40-200 nm，外泌体组成结构为脂质双分子膜包裹少量胞质，胞质中含有源细胞的各种成分，包含大量蛋白质、脂质和核酸等。根据外泌体内容物数据库统计（http://www.exocarta.org），目前已确定9769种蛋白质、1116种脂质、3408种mRNA和2838种微RNA（microRNA，miRNA）存在于不同组织和细胞来源的外泌体中，其中包括外泌体所共有的普遍性组分和根据外泌体来源不同而特有的组分，这些内容物在外泌体介导的细胞间物质和信息交流过程中均起关键作用。2013年，Cazzoli等将检测血浆外泌体中的miRNAs（miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p）作为肺癌的“筛查试验”，结果显示敏感度和特异度分别为97.5%和72%，ROC曲线下面积为90.8%；随后将检测外泌体中的6种miRNAs（miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p）作为肺癌的“诊断试验”，结果显示敏感度和特异度分别为96.0%和60.0%，ROC曲线下面积为76.0%。2014年，Ogata-Kawata等人比较了88例结肠癌患者和11例健康对照组血浆中的外泌体的7种miRNAs（let-7a、miR-1229、miR-1246、miR-150、miR-21、miR-223和miR-23a）表达，发现它们在结肠癌患者中的表达显著高于健康对照组；对于I期结肠癌患者，miR-23a和miR-1246同样具有高度的敏感度，分别为95%和90%，而CA199和CEA的敏感度分别只有10%和15%；又对29例结肠癌患者手术前后的7种miRNAs进行检测，发现手术后的表达水平均有显著下降。由此说明，血浆外泌体的miRNAs表达，可以作为一种新的早期筛查和诊断试验。