[发明专利]干细胞用胰蛋白酶终止液制备方法及干细胞传代方法

说明书

本发明提供了一种干细胞用胰蛋白酶终止液制备方法，包括以下步骤：S1、收集组织；S2、物理破碎；S3、超声破碎；S4、过滤除菌。一种干细胞传代方法，包括以下步骤：A1、制备脐带间充质干细胞或制备胎盘间充质干细胞；A2、制备的脐带间充质干细胞或胎盘间充质干细胞融合达80%后应及时进行传代。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明的优点是：不含外源血清，可用于无血清培养体系；非动物源性，没有外源性病毒污染的风险；与被消化的贴壁干细胞来源于同一个体组织，不引入外源性蛋白，不会增加临床免疫反应的风险。制作成本低，操作简单。制作原料是分离干细胞后废弃的胎盘和脐带组织，节约资源。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域。

具体地说，是涉及干细胞用胰蛋白酶终止液制备方法及干细胞传代方法。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的原始细胞，被医学界称为“万用细胞”。干细胞不仅可以分泌多种生长因子对组织器官进行修复调节，还能分化成多种功能细胞，为有效修复人体重要组织器官损伤，治愈心脏疾病、骨科疾病、代谢性疾病、及自身免疫性疾病等重要疾病提供了新的途径。以干细胞治疗为核心的再生医学，将成为继药物治疗、手术治疗后的另一种疾病治疗途径，从而成为新医学革命的核心。

间充质干细胞等贴壁干细胞的传代培养过程，需要将贴壁细胞消化下来，这就需要用到胰酶或胰酶替代物等消化酶，虽然现在已经有商品化的无需终止的胰酶替代物，但是由于胰酶的价格低，消化效果好，大多数企业还是倾向于选择用胰酶进行贴壁干细胞的消化。终止胰酶消化的传统方法是用含血清的完全培养基来终止消化，但是在无血清培养体系中胰酶的终止该怎样进行呢。现有商品化的胰酶抑制剂价格昂贵，大大提高了企业的试剂成本，而且商品化的胰酶抑制剂多是从牛肺等动物肺脏中提取的，有外源性病毒污染的风险，即使是利用大肠杆菌重组的胰酶抑制剂也属于外源性蛋白，增加临床上发生免疫反应的风险。也可以通过大量稀释法来减缓胰酶的消化作用，但是对细胞的损伤相对较大，所以好多企业现在实际上还是用少量的血清作为胰酶的终止液。

综上所述，现在临床级贴壁干细胞急需一种可用于无血清培养体系，不会引入外源性蛋白，不会有感染外源病毒的风险，不会增加临床上发生免疫反应的风险，制作成本低，操作简单，能有效终止胰酶消化作用的胰酶终止液。

发明内容

本发明的目的在于克服上述传统技术的不足之处，提供一种干细胞用胰蛋白酶终止液制备方法及干细胞传代方法，终止液与被消化的贴壁干细胞来源于同一个体组织，不属于外源蛋白，不会有引入外源病毒的风险，不会增加临床上发生免疫反应的风险，制作成本低，操作简单，能有效终止胰酶对贴壁细胞的消化作用，减少对细胞的损伤。

本发明的目的是通过以下技术措施来达到的：

干细胞用胰蛋白酶终止液制备方法，包括以下步骤：

S1、收集组织，收集脐带或胎盘组织，作为制备胰蛋白酶终止液的原料；

S2、物理破碎，将收集的组织先预制成块状，然后将组织块放入组织粉碎机中粉碎，彻底粉碎至组织呈稀糊状，用含Ca²⁺、Mg²⁺离子、PH为6.5-7.0的无菌PBS溶液稀释，充分混合均匀，然后用100目细胞筛过滤，除去其中的组织块，最后收集所有滤液及洗液；

S3、超声破碎，将收集到的滤液破碎，超声条件为30%-40%功率下超声破碎2-3s，停3-9s，循环20-30次，然后1000-2000rpm离心5-10min除去未破碎细胞，去沉淀，重复离心2-3次，取上清液；

S4、过滤除菌：收集到的上清液，先用0.40-0.50um的微孔滤膜过滤，再用0.20-0.25um的微孔滤膜过滤。

作为一种改进：步骤S1中，制备原料是分离干细胞后废弃或剩余的胎盘或脐带组织。