[发明专利]一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法

说明书

一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法，该单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区由连接肽连接；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。本发明的单链抗体能够与猪瘟病毒特异性结合，直接由重组疫苗进行体内表达，可快速、高效诱导中和抗体的产生，不依赖于机体免疫系统，用于阻断猪瘟病毒的感染。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法。

背景技术

猪瘟疫苗免疫常因不能诱导产生有效的中和抗体而导致免疫失败。在疫苗的研究中，通过筛选单克隆中和抗体，用重组表达载体来构建表达猪瘟中和抗体蛋白的重组菌毒株，进而研发出抗体疫苗。

自20世纪70年代以来，小鼠杂交瘤细胞技术以及噬菌体展示技术已经成为筛选和制备单克隆抗体的通用技术手段，目前在国内外已上市的抗体药物绝大部分也是运用这两种技术获得的。

这两种技术方法具有很多优点，比如筛选获得的单克隆抗体特异性强、亲和力高，然而也有很多不足，包括筛选花费时间较长、不能获得天然抗体的重链和轻链配对信息、后期需要人源化改造以及亲和力成熟等问题。

采用单个B细胞技术获得抗体疫苗不仅能达到快速、高效诱导中和抗体产生的目的，而且中和抗体的产生不依赖于机体免疫系统，直接由重组疫苗进行体内表达，达到治疗和预防的目的。

然而，所报道的单细胞扩增法在第一步操作复杂，如实验步骤繁多，单个B细胞需要单个培养，很容易交叉培养，对结果造成影响；同时试剂和仪器价格昂贵，这些都是亟待改进的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体及其制备方法，该单链抗体能够与猪瘟病毒特异性结合，直接由重组疫苗进行体内表达，可快速、高效诱导中和抗体的产生，不依赖于机体免疫系统，用于阻断猪瘟病毒的感染。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体，其包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区由连接肽连接；所述重链可变区的氨基酸序列如SEQID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQID No.2所示；所述连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

进一步，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体具有如SEQID No.3所示的氨基酸序列。

一种编码所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的基因。

一种所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的表达载体，其由猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体pET28或pET30重组构建得到。

优选地，所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体基因与原核表达载体通过双酶切位点连接。

又，所述双酶切位点为NcoI和NotI，NcoI的序列为CCATGG，NotI的序列为GCGGCCGC。

一种筛选所述猪源性抗猪瘟病毒的单链抗体的方法，具体步骤如下：

1)以猪瘟活疫苗作为传代细胞源，对猪进行注射免疫；

2)从免疫猪的外周血中分离淋巴细胞，利用带FITC标记的猪瘟病毒E2蛋白，以流式细胞术对分离出的淋巴细胞进行分选，选出能够结合FITC标记及猪瘟病毒E2蛋白的B细胞；

3)将分选出的B细胞稀释，接种后进行培养，连续培养3-5天，收集淋巴细胞上清液；

4)以猪瘟病毒作为包被抗原，用Elisa方法对收集的淋巴细胞上清液进行筛选，筛选出亲和力好的阳性抗体；