[发明专利]EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品

说明书

本发明涉及一种EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法，检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，突变型模板是酶切后的插入EGFR基因L858R突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，确定背景阈值。通过本发明的EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

技术领域

本发明涉及检测人类EGFR基因L858R突变的数字PCR检测产品及其优化方法，属于生物技术领域。

背景技术

在世界范围内，肺癌是肿瘤性死亡首因，严重危害着人类的健康。全球每年约有150万的人死于肺癌。空气污染的污染，吸烟的影响等都进一步加剧了肺癌的发生。肺癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。因此，肺癌的早期诊断及治疗一直是研究的终点，也是防治肺癌的关键。

表皮生长因子受体(EGFR)属于络氨酸激酶型受体，贯穿细胞膜，其胞内部分为其激酶活性区域，是原癌基因。表皮细胞生长因子受体络氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)对具有EGFR激活突变的非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有显著疗效。在NSCLC的组织类型中，亚裔肺腺癌患者的EGFR基因突变率高达60％，其中21号外显子L858R点突变的频率约30％。有研究指出对于具有L858R突变患者靶向治疗和化疗治疗效果相似甚至化疗效果更优。因此，治疗前应对L858R位点进行检测。

传统的检测EGFR基因L858R点突变常用的标本为病理组织或细胞学标本，但是组织取材具有创伤性特点。受到肿瘤大小和部位的影响，时常难以取得满意的组织或无法取样。与此同时，随着疾病的进展，需连续进行取样，而组织取样为有创操作无法进行便捷、反复进行。血浆游离DNA(cfDNA)是一种能够代替肿瘤组织用来检测肿瘤特异性改变的样本。肿瘤组织、肿瘤细胞坏死及脱落的肿瘤细胞进入血液后凋亡释放游离DNA(ctDNA)进入外周血。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创，可实现实时检测和动态监测，克服肿瘤组织的异质性。然而，使用cfDNA检测EGFR基因突变仍存在一些挑战。cfDNA含量因人而异，并且大多数人含量较低；cfDNA片段较短，最大约为180bp；cfDNA中来自于肿瘤细胞的ctDNA含量较低，甚至只能占总cfDNA的万分之一；而传统检测方法检测灵敏度只能达到百分之一。

数字PCR(dPCR)的出现促进了传统PCR检测的发展，极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴，大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数，理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此，数字PCR可以达到绝对定量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法，以及通过该优化方法优化后的检测产品。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因L858R突变数字PCR检测体系的优化方法，所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因L858R突变片段的突变质粒；