[发明专利]用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法，试剂盒，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06‑0.15U/ul USER酶，PCR扩增体系，磁珠；检测方法通过建立测序文库进行ccfDNA的全基因组测序；再经过全基因组数据处理、建立统计和建立机器学习模型来检测病人ccfDNA的拷贝数的异常从而达到肝癌的早期诊断；这样的检测方法最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性，特别是对肝癌一期的检测。

技术领域

本发明涉及肝癌诊断辅助领域，特别是一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法。

背景技术

肝癌是恶性度非常高的肿瘤，一旦转移基本没有有效的治疗方案，存活率很低。肝癌如果诊断在早期，还可以接受手术或者肝移植的时候，五年存活率可以达到70％。如果已经转移的话，五年存活率只有5％左右。所以早期诊断对病人的生存至关重要。

常规的肝癌的诊断主要是通过甲胎蛋白(AFP)进行筛查，对于高风险人群再通过超声，核磁等影像学手段进一步检查，发现可疑病灶时确诊的手段是肝穿刺活检。但是，超声的灵敏度有限，而且不能确诊。常规的肝穿刺活检有很大的侵入性，而且有引起肿瘤扩散的风险。由于肿瘤有普遍的肿瘤内的异质性，很多时候肝穿刺活检并不能显示肿瘤的全貌。

对应于影像学检查和肝穿刺活检，市场更需要一种使用液体活检来完成肝癌的早期诊断的非侵入性手段。液体活检主要依赖灵敏的技术来检测血液里的游离的DNA(ccfDNAs)里面的肿瘤特有的DNA(循环肿瘤DNA,circulating tumor DNA，ctDNA)；如图3所示，由于释放到血液里的肿瘤DNA的量跟肿瘤的大小和肿瘤的临床分期密切相关，而早期的肿瘤释放到血液里的DNA很少，用液体活检来诊断早期肿瘤有很大的挑战。市场需要针对早期肝癌诊断的试验手段，计算方法和机器学习模型，来最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性；本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法，本发明通过建立测序文库进行ccfDNA的全基因组测序；再经过全基因组数据处理、通过机器学习来建立统计模型来检测病人ccfDNA的拷贝数的异常从而达到肝癌的早期诊断，这样的检测方法最大限度的提高液体活检对早期肝癌诊断的准确性，特别是对一期肝癌的检测。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06-0.15U/ul USER酶，PCR扩增体系，磁珠。

前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，ccfDNA末端处理体系组成有：ccfDNA，0.003-0.007U/ul的T4DNA聚合酶，0.1-0.3U/ul的T4多聚核苷酸激酶，0.0015-0.0035U/ul的TaqDNA聚合酶，1x T4DNA连接酶缓冲液，0.2-0.6mM dNTP,0.1-0.3mM ATP，2.5％的粘合剂。

前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，环状接头反应体系组成有：0.1-0.3U/ul的T4连接酶，1xT4连接酶缓冲液，和0.7-1.2uM的环状接头，所述环状接头序列：5’-P-GATCGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C dU A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCTTCC GAT CT-3’。

前述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，PCR扩增体系按照体积份数组成有：15-25份DNA片段，3-8份的引物1和引物2，20-30份的PCR反应master mix；

所述Master mix包括：2x PCR多聚酶和2x的PCR反应缓冲液。

所述引物1的3’端与环状接头的5’端互补，5’端是用于Illumina测序的P7引物，中间是标签；