[发明专利]靶向HPV亚型16/18癌基因E6/E7的CRISPR/Cas9系统

说明书

本发明公开了一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其包含Cas9和分别靶向癌基因E6/E7的两种sgRNA，所述sgRNA是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2：或者是选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种。本发明的CRISPR/Cas9系统可用于制备宫颈癌治疗药物。

技术领域

本发明属于属于分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统、及其在制备宫颈癌治疗药物中的用途。

背景技术

宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒(HPV)的感染密切相关。已知的HPV亚型16和亚型18两种病毒造成了70％以上的宫颈癌病例。临床治疗宫颈癌是手术切除，放射治疗，化疗。虽然防治人类乳头瘤病毒感染已有疫苗产品市售，但是成年人在已经接触到HPV16/18感染后，疫苗几乎无效。

HPV病毒是一个小的双链环状DNA病毒(7.9kb)。位于早期区的E6、E7基因是HPV病毒的致癌基因。E6表达会使肿瘤抑制蛋白p53降解，而E7基因的表达，抑制pRb活性，使细胞周期调节紊乱。E6/E7两者共同作用，导致细胞的永生化，引发癌症。因此阻断E6/E7癌蛋白表达，可恢复p53和pRbd的正常表达，引起癌细胞凋亡。同时，由于切断了病毒E6/E7基因，阻断病毒增殖，理论上可达到清除机体中病毒的目的。

CRISPR系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是在细菌及古细菌种发现的一种抵御质粒病毒感染的免疫机制，其通过生物工程设计一段作为引导工具的小核酸，引导一种名叫Cas9的特殊核酸酶到特定基因组，对生物的DNA序列进行切割或替换。CRISPR/Cas9技术有许多潜在的应用，可以用于人类基因组编辑以治疗遗传缺陷病或基因突变疾病；删除病原体基因，如细菌的基因组或病毒基因组，消灭病原体，达到消除传染性疾病。CRISPR基因编辑技术是彻底治愈遗传缺陷疾病和传染性疾病的有效方法和希望。

为了能有效治疗宫颈癌，发明人研究了使用CRISPR基因编辑技术的可能性。通过切断人类乳头瘤病毒癌蛋白E6、E7基因，破坏癌蛋白表达，从感染机体中消除病毒。结合子宫颈癌的手术治疗和化疗，清除患者体内的HPV病毒，让患者避免重复感染，达到治愈子宫颈癌目的。

发明内容

在基因编辑技术的研究中，发明人对靶向人乳头瘤病毒癌基因E6/E7基因序列的sgRNA(single guide RNA，单导向RNA)进行了大量的筛选，发现有17种sgRNA能够高效率地靶向E6/E7，其中的5种sgRNA能够以表达载体比如双靶表达质粒形式在细胞内表达，产生的sgRNA分子可高效地引导核酸酶Cas9靶向癌基因E6和E7，切割E6/E7癌基因，导致了癌细胞的死亡。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于

一种用于对人乳头瘤病毒HPV亚型16/18的癌基因E6/E7进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统，其包含核酸内切酶Cas9和分别靶向癌基因E6/E7的两种sgRNA，所述sgRNA是SEQID NO:1和SEQ ID NO:2：

5’-UUUCAAUGGUGUCAAUACGU-3’(SEQ ID NO:1)，

5’-GCGAAGCCAACACGCAUGUUU-3’(SEQ ID NO:2)；或者

所述sgRNA是选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中的任意两种：

5’-GUUCGAUGGACUAGACACGU-3’(SEQ ID NO:3)，

5’-CGUCGACAAAGACUUGUGGG-3’(SEQ ID NO:4)，