[发明专利]基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了基于氧化石墨烯的荧光增强型的适配体传感器，用于快速高灵敏度检测嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌，以及对其在鱼体内(如鲫鱼)进行成像。我们的方法可以为鱼类病原菌的快速鉴定和成像提供一种新方法，这为将来开发用于病原菌的示踪，诊断和治疗的新型纳米生物传感系统提供了机会。

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器及其制备方法和应用。

背景技术

随着世界渔业的快速发展及水产养殖环境的日益恶化，致病菌引起的各种鱼类疾病已成为影响水产养殖业的重要威胁因素。嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(E. tarda)作为水产养殖中的常见病原菌，不仅给水产养殖业带来巨大经济损失，而且还会对鱼类和人类造成疾病。因此，发明一种快速，灵敏，高特异性，低成本的检测鱼类病原菌(如 A.hydrophila和E.tarda)的方法具有重要意义。传统的鱼类病原菌的检测方法，如生化培养， PCR和免疫诊断技术，都受到过程或样品制备过程复杂，分析时间长，成本高和低特异性等缺点的限制。近年来，将生物分子识别元件(如酶、抗体、噬菌体、适配体等)结合荧光、电化学、比色等信号转换系统构建生物传感器用于检测病原菌的分析方法引起了许多研究者的兴趣。在上述可能的识别检测的策略中，基于抗体识别的方法简单且具有高度选择性，但是依赖于动物中产生的抗体，其成本较昂贵并且重复性差。因此，迫切需要开发一种基于新型分子探针的简单方法，用于快速，高灵敏地检测鱼类病原菌。

适配体，被称为“人工抗体”，与天然抗体相比具有明显的优势，如结构简单，成本低，不易变性和失活。因此，许多研究人员使用适配体作为新的识别元件结合不同的分析方法来检测细胞、细菌和肿瘤标志物等分子。王周平等人将适配体作为识别分子与信号转换系统相结合，如表面增强拉曼散射(SERS)和上转换荧光分析，构建了适用于检测鼠伤寒沙门氏菌 (Salmonella typhimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的适配体传感器平台。郑磊等人开发了一种基于催化发夹组装(CHA)和双功能适配体检测癌细胞的荧光方法。这些基于适配体识别和检测的方法在生物分析和早期诊断方面具有巨大潜力。尽管已经有一些检测鱼类病原菌(如副溶血性弧菌和哈维氏弧菌)的文章。然而，却没有关于使用适配体结合纳米材料检测A.hydrophila和E.tarda的报道。氧化石墨烯(GO)是一种新型的碳二维纳米材料，易于合成，具有优异的光学和胶体稳定性以及高消光系数等特性。GO具有较高的比表面积和丰富的表面官能团，使其具有良好的亲水性和相容性，光响应性能，小尺寸效应等特性。此外，氧化石墨烯及其衍生物已广泛应用于生物传感、生物成像、药物靶向运输、组织工程等领域。

发明内容

为了解决现有技术的不足本发明提供了一种基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器用于快速检测嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(E.tarda)。

本发明的技术方案是：基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制备方法，以GO 作为猝灭剂，猝灭用羧基荧光素FAM标记的适配体Aptamer 1和Aptamer 2的荧光后制得。

本发明的进一步改进包括：

将0.02mg/mL氧化石墨烯与200nM适配体Apt1和Apt2，在结合缓冲液即50mM Tris-HCl，100mM NaCl，5mM KCl，1mM MgCl₂，pH 7.4中混合反应8min即得。

本发明的另一目的在于提供了基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器的制得方法。

本发明还提供了具有FAM标记的两种适配体Aptamer 1和Aptamer 2作为荧光探针在制备基于氧化石墨烯的荧光增强型适配体传感器中的应用。