[发明专利]一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法

说明书

本发明涉及一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液，所述注射液是含毛乳头细胞外泌体的生理盐水溶剂，其制备方法包含毛乳头细胞的分离、毛乳头细胞的贴壁培养、毛乳头细胞的刺激诱导培养、外泌体冻干粉的制备、注射液配置五个步骤。本发明的制备方法获得的毛乳头细胞分泌的外泌体量大、且促进毛发再生的有效成分含量高，从而注射液治疗雄激素源性脱发效果好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法。

背景技术

雄激素性脱发（AGA）的患病率随年龄增长而增加，并且会影响无论男女。被诊断患有AGA的患者可能经历生活质量下降的困扰。虽然天然和合成成分可以用于治疗AGA，促进毛发生长，但它们具有严重的副作用和未知的作用机制，限制了它们的使用。目前有研究利用患者自身正常毛发的毛囊，分离出对毛囊再生起关键作用的真皮乳头细胞（DPC），在体外培养、增殖获取其外泌体，注射到患者秃发区，从而生成新的正常的毛发。研究者进一步发现，外泌体促进生发的作用发挥过程中，外泌体所携带的Wnt1a蛋白刺激受试者毛囊部位毛乳头（DP）细胞诱导毛发循环从而促进毛发的再生。

但是由于现阶段干细胞外泌体的收集很难达到治疗要求量，同时在不同环境不同PH及不同诱导条件下，所分泌的外泌体量和外泌体所包含主要物质的种类差异较大，都给外泌体的研究及临床应用带来困扰。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，制备过程获得的毛乳头细胞分泌的外泌体量大、且促进毛发再生的有效成分含量高，从而注射液治疗雄激素源性脱发效果好。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，所述注射液是在不含血清的基础培养基中获取的含毛乳头细胞外泌体的生理盐水溶剂，其制备方法包含以下步骤：

（1）毛乳头细胞的分离；

（2）毛乳头细胞的贴壁培养：将所述步骤（1）中获得的毛乳头细胞进行贴壁培养；

（3）毛乳头细胞的刺激诱导培养：当所述步骤（2）中贴壁培养获取的原代毛乳头细胞传至第三代时转入细胞培养系统，并在三气培养箱中培养，培养至第7天时，降低培养箱内氧气浓度为0.1～3%，同时加入终浓度为1 ~ 5*10⁻⁴ M的米诺地尔进行刺激诱导；刺激诱导24h后，移去所述步骤（2）的贴壁培养的培养基，并用不含血清的基础培养基清洗3次，换培养基为不含血清的基础培养基，更换氧气含量为5%；

（4）外泌体冻干粉的制备：所述步骤（3）中在不含血清的基础培养基中培养24 ~48 h后，收集细胞上清液，经过低温超速离心并用PBS溶解后获取毛乳头细胞外泌体；计数分装入安瓿瓶，放置于-50～-80℃的温度下进行冷冻处理，然后于-50℃冻干处理，得到毛乳头细胞外泌体冻干粉；

（5）注射液配置：所述毛乳头细胞外泌体冻干粉用生理盐水溶解为含毛乳头细胞外泌体的生理盐水溶剂。

进一步地，所述步骤（1）中毛乳头细胞的分离包含以下步骤：

a. 经过手术后的单个毛囊置于毛囊采集液中于4℃环境保存，用含质量分数1%双抗的PBS溶液清洗毛囊组织2～3次；

b. 显微镜下用1ml注射器针头将毛球部组织整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至新的含PBS溶液的培养皿中；

c. 将PBS清洗一次后加入0.2% 胶原酶IV，在37℃温度下消化1～2 h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头细胞，放置入一个新的培养皿中。