[发明专利]一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用

说明书

本发明提供一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，属于基因药物技术领域，构建ABCA1融合表达载体和CD9融合表达载体，ABCA1融合表达载体中为ABCA1的CDS序列和串联的RNA结合蛋白识别序列，CD9融合表达载体为CD9的CDS序列和对应的RNA结合蛋白编码基因，将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染肝细胞，培养后收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体。所述构建方法可提高ABCA1 mRNA加载外泌体中的效率，克服分子量大的ABCA1 mRNA分子无法有效装载到外泌体的问题，获得大量含有ABCA1 mRNA的外泌体。

技术领域

本发明涉及基因药物技术领域，尤其涉及一种装载ABCA1 mRNA的外泌体及其构建方法和应用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑梗死、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。

传统动脉粥样硬化的防治主要是通过他汀类药物，降低胆固醇的合成。然而这一传统方法并没有真正针对LDL-c升高和HDL-c降低的原因，而只是简单直接的降低胆固醇的合成。

三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1，ABCA1)以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂流出，并结合到细胞表面贫脂的载脂蛋白AⅠ(apoA-Ⅰ)，这一过程对于减少血管壁脂质蓄积、泡沫细胞形成和血管壁验证反应均有重要意义。ABCA1是肝脏控制HDL(高密度脂蛋白胆固醇)表达的重要分子，是初始HDL形成的关键分子。流行病学研究发现部分患者存在ABCA1的多态性。增加ABCA1的表达，可以改善HDL水平，对ABCA1表达障碍及HDL相对不足的患者具有潜在的作用。然而，如何增加肝脏表达ABCA1成为关键问题。

外泌体能够高效递送其包裹的蛋白或核酸进入肝脏。如何将治疗具体疾病的基因加载入外泌体是一个重要的科学问题，特别是ABCA1分子量大，不容易装载。

发明内容

本发明为了解决现有技术中分子量大ABCA1无法装载到外泌体的问题，提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，成功将ABCA1的mRNA包装入外泌体中，所得装载ABCA1 mRNA的外泌体能够有效增加肝脏ABCA1蛋白的表达，从源头上促进HDL合成，可用于制备预防或治疗粥样动脉硬化的药物中。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种装载ABCA1 mRNA的外泌体构建方法，包括以下步骤：

(1)构建ABCA1融合表达载体，所述ABCA1融合表达载体包括ABCA1的CDS序列与串联的RNA结合蛋白识别序列；

(2)构建CD9融合表达载体，所述CD9融合表达载体包括膜蛋白CD9的CDS序列和RNA结合蛋白编码基因；

(3)将ABCA1融合表达载体与CD9融合表达载体共转染至肝细胞，培养转染后肝细胞，收集外泌体，即得装载ABCA1 mRNA的外泌体；

所述串联的RNA结合蛋白识别序列选自RNA结合蛋白反应元件AREs或RNA结合蛋白反应元件QREs：

当所述串联的RNA结合蛋白识别序列为RNA结合蛋白反应元件AREs时，所述RNA结合蛋白编码基因为RNA结合蛋白HuR编码基因；