[发明专利]一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法

权利要求书

1.一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法，其特征在于：用于培养毛细胞的培养液，其组成包括：葡萄糖3g、酚红钠0.01g、丙酮酸钾0.15g、盐酸左旋精氨酸0.08g、胱氨酸0.05g、丙氨酰谷氨酸0.90g、甘氨酸0.02g、组氨酸0.05g、亮氨酸0.12g、盐酸左旋赖氨酸0.15g、左旋蛋氨酸0.03g、苯丙氨酸0.07g、丝氨酸0.04g、左旋苏氨酸0.11g、左旋色氨酸0.02g、左旋酪氨酸0.07g、颉胺酸0.12g、泛酸鈣0.004g、氯化胆碱0.004g、叶酸0.004g、肌醇0.007g、烟酰胺0.004g、盐酸吡多辛0.004g、核黄素0.0004g、盐酸硫胺0.004g，培养液中还包含有无机盐，余量为蒸馏水；然后按照50-90ng/ml的浓度加入小分子多肽。

2.根据权利要求1所述的一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法，其特征在于：培养液的钾离子水平范围在130-145mEq/L，钠离子水平范围为＜10mEq/L。

3.根据权利要求1所述的一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法，其特征在于：具体步骤如下：

选取出生后3天的小鼠，将生物安全柜严格紫外消毒至少30分钟，将备好的实验器械75％酒精浸泡并同时紫外消毒。75％的酒精喷洒小鼠头颈部进行表面皮肤消毒。在小鼠枕骨大孔处断头，沿矢状缝使用眼科剪去除头盖骨，使用镊子小心去除左右两侧的脑组织，沿中间剪开分离左右侧颞骨，将颞骨置入预冷无菌的Ca²⁺-Mg²⁺平衡的Hank’s平衡盐溶液中。在放大25～40倍的解剖显微镜下使用5号精细镊子去除颞骨听泡及周围组织，暴露并分离出耳蜗；去除周边组织,分离出带柯替氏器的基底膜；显微分割出内毛细胞区及外毛细胞区，得到小段细胞簇；用带缓冲液的玻璃吸管分别吸取分割后的内外毛细胞簇，再吹出于载玻片上获得离单的内外毛细胞，培养于上述培养液中，可保持细胞活性达5天以上。

4.根据权利要求3所述的一种小鼠耳蜗毛细胞培养方法，其特征在于：在CO₂细胞培养箱中培养，条件为20％O₂，5％CO₂，75％N₂，37℃。