[发明专利]中间克吕沃尔菌ZJB-17004及其应用

说明书

本发明涉及一株中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB‑17004及其应用，其对催化N‑苯乙酰‑DL‑氨基酸生产L‑氨基酸对映体选择性值达到98％，对催化2‑N‑苯乙酰基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑DL‑丁酸制备2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑L‑丁酸对映体选择性值达到99％。

(一)技术领域

本发明涉及一株产酰胺水解酶的菌株——中间克吕沃尔菌(Kluyveraintermedia)ZJB-17004，及其在催化N-苯乙酰基氨基酸制备手性氨基酸与催化氨基酸衍生物的N-苯乙酰基取代物制备手性氨基酸衍生物中的应用。

(二)背景技术

L-草铵膦化学名称为：4-[羟基(甲基)膦酰基]-L-高丙氨酸，是L-谷氨酸的一种结构类似物，能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)活性，使植物体内氨积累，高浓度氨气积累阻断植物光呼吸作用，叶绿体结构的破坏以及基质的囊泡化，同时氨基酸合成受阻，导致细胞膜受损和细胞死亡，从而杀灭杂草。其具有广谱性，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。

目前L-草铵膦合成方法有化学合成法和生物合成法。化学法主要通过以下4种方式构建L-草铵膦的手性中心：1)利用手性辅助试剂，手性诱导构建手性中心；2)以天然氨基酸为手性源，转化得到L-草铵膦；3)由手性催化剂催化的不对称合成反应；4)手性拆分外消旋体。但是化学法合成L-草铵膦工序多，收率较低，手性试剂成本高昂，且产生的三废量大，处理比较困难。生物法则具有严格的立体选择性，温和的反应条件、较高的收率和易于分离纯化等优势，因此，生物法生产L-草铵膦技术具有十分重要的产业化开发价值。

生物法生产L-草铵膦根据作用底物不同有蛋白酶水解双丙氨膦、通过磷酸二酯酶I、酰胺酶I和谷氨酰胺酶分步协同作用保持光学活性水解L-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺、α-胰凝乳蛋白酶的拆分双丙氨膦乙酯、脱乙酰基酶拆分N-乙酰-草铵膦、酰胺酶拆分2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、酯水解酶水解L-草铵膦-N-羧酸酐、腈水合酶水解草铵膦含腈底物、转氨酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸等。

目前合成L-草铵膦的化学方法主要有：1)手性辅助剂诱导法，以(S)-2-羟基-3-蒎酮为手性辅助剂制备，产率为51％，e.e.值为79％；以D-缬氨酸甲酯为手性辅助剂，需要-78℃低温反应，产率为51％，e.e.值为93.5％。2)天然氨基酸手性源法，以L谷氨酸为手性源，e.e.值为99.4％；L-蛋氨酸为手性源，总收率为42.3％，e.e.值为93.5％，需要用到剧毒碘甲烷。3)不对称合成法，不对称催化加氢——催化剂用量大且三甲基硅氰价格昂贵；不对称Strecker反应——用到剧毒氰化物；不对称Michael加成——催化剂用量大，且产品收率和e.e.值低。4)外消旋体拆分法，此方法最高收率86％，e.e.值最高99％，但拆分后D-草铵膦未转化，浪费原料。

用酰胺水解酶选择性催化拆分2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，为实现工业化路线的L-草铵膦合成提供了依据。

手性氨基酸及其衍生物在医药开发中的作用越来越大，目前的医药开发对手性纯度的要求越来越高。手性氨基酸生产工艺有化学拆分和酶法拆分等工艺。其中酶法拆分因为其条件温和，特异性强，污染小，较化学拆分有明显优势。其中酰胺水解酶选择性催化拆分N-苯乙酰基氨基酸生产手性氨基酸具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种能够产生酰胺水解酶的菌株——中间克吕沃尔菌(Kluyvera intermedia)ZJB-17004，及其在催化N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物(2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-DL-丁酸)制备L-草铵膦的重要有效成分L-氨基酸衍生物(2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸)或催化N-苯乙酰-DL-氨基酸制备L-氨基酸中的应用，为化学-酶法生产L-草铵膦有效成分及L-氨基酸提供了新的酶源，促进了绿色化学催化的发展。