[发明专利]一种RFF1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种RFF1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；

S5)以筛选的精准多肽负载PBMC，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；

S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击；

S7)冲击后继续培养，以得到RFF1细胞。

2.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，以得到FF细胞包括：

将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；

培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；

培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。

3.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S5中，负载精准多肽后的PBMC细胞与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1:1～1:20的比例混合。

4.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S6中，在共培过程中，重复多肽冲击3～4次。

5.根据权利要求4所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S6中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。

6.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S6中，在共培过程中用精准多肽进行多肽冲击包括：

将负载精准多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC混合后在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击；

转移至含有培养液OKM100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养，每隔3～4天分别用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击。

7.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，利用CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子。

8.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

1)外显子测序

对肿瘤细胞进行全外显子测序；

将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

2)抗原表位预测

以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；

IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

3)合成多肽

采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。

9.根据权利要求8所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，所述细胞工程系包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。