[发明专利]一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用

说明书

本发明属于辅助病毒的构建领域，公开了一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用。本发明利用双链腺相关病毒（SCAAV）作为辅助病毒载体分别装载TVA受体和狂犬病毒外膜糖蛋白（RVG），并包装成病毒，用于ENVA外膜包裹的缺陷型重组狂犬病毒的特异性识别和逆行跨突触标记。经过活体测试结果表明，本发明建立的重组缺陷型狂犬病毒RV‑△G‑X‑ENVA与辅助病毒SCAAV组合系统，可以实现快速逆行跨突触标记，较传统的单链AAV病毒辅助方法节省1‑2周的实验时间，节省物力人力，为缺陷型狂犬病毒在神经网络逆向跨突触标记中的应用上提供了更好的研究工具，为神经网络的结构与功能解析奠定了很好的技术支撑。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种神经细胞快速逆行跨突触标记的方法及应用。

背景技术

解析大脑神经网络连接，是理解大脑工作机制及脑疾病网络变异机制的基础。传统的神经网络示踪方法，少数蛋白质类示踪剂，如WGA、HRP等,能初步实现大脑核团间的投射关系，但这些示踪方法具有信号间接、方向不特异、跨突触后信号衰减严重等问题。上述传统示踪方法促进了人们对大脑神经网络结构的认识，但难以用于研究由多个脑区、多种类型神经元通过突触连接形成的复杂神经网络。利用改造的嗜神经工具病毒(Neurotropicvirus)，跨突触追踪大脑的神经网络，是目前最有效的标记结构神经网络的技术。嗜神经病毒是一类能感染神经细胞，且能沿神经环路传播增殖的病毒。利用嗜神经病毒作为示踪工具，与传统的示踪剂相比有如下特点：(1)可以跨突触传播；(2)跨突触方向可控，可特异顺行或逆行传播；(3)病毒跨突触后可复制，信号不衰减；(4)可携带多种标示物。上述特性使其在示踪大脑神经网络结构的研究中显示出独特优势。

改造的狂犬工具病毒(RV)能实现严谨的跨单突触标记，可精确解析神经回路，在近几年广泛应用于神经科学研究，成为神经结构回路解析的工具之一，Wickersham等在2007报道了基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆构建的重组狂犬病毒，其G蛋白基因被敲除，并携带GFP、mCherry等荧光蛋白基因，可使外源蛋白在神经元中高丰度表达，从而清晰地标记神经元的精细形态。他们建立了RV的ENVA-TVA系统，实现了RV特异逆行跨突触的特性，并已被多个实验室使用。

腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组小于5kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在神经科学领域也得到广泛的应用。AAV感染细胞后，需要经历一个由单链转变为双链的过程，而病毒DNA第二链的合成已被证明是病毒基因表达的限速步骤，直接影响到病毒的转导效率。双链AAV病毒(self-complementary AAV,scAAV)是在单链AAV病毒(ssAAV)右边的ITR删除了一个D序列(包装信号)，同时突变末端解链位点(Δtrs)，阻止了Rep蛋白修饰调节解链切口，增强自我互补双链DNA的包装。双链AAV病毒进入细胞后，不需要一个由单链变为双链的过程，基因表达更为快速，表达水平可能更高。但双链AAV的载量只有单链AAV的一半，大约2.5kb(Wang Z et al.,Gene Ther.2003,10(26):2105-11.)。

然而，现有技术使用缺陷型RV结合单链AAV辅助病毒实现逆行跨单突触标记，需要提前在起始脑区注射AAV辅助病毒2-3周后，使外源基因大量表达后再注射缺陷型RV并表达一周，此方法需要的实验周期比较长，大约需要一个月的时间。而双链AAV的载量有限，且辅助基因RVG的大小也比较大，为1575bp，其能否装载到双链AAV上并成功拯救出病毒和实现特异性在cre转基因鼠上表达与辅助缺陷型RV跨突触的功能，一直未见报道。