[发明专利]一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)取外周血，肝素抗凝，采用淋巴细胞分离液分离，得到PBMCs；

(2)向无血清培养基加入5-10v％的自体血浆，然后加入唑来膦酸、IL-2和IL-15，得到γδT细胞刺激培养基，使用γδT细胞刺激培养基悬起PBMCs，并调整密度至2-4×10⁶个细胞/mL，接种于培养瓶中，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(3)待步骤(2)中培养至第3d时，离心去除刺激培养基，使用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调整到2-4×10⁶个细胞/mL，以后每2-3d根据细胞密度补充扩增培养基，使细胞密度维持在2-4×10⁶个细胞/mL，每天检测γδT细胞纯度，当γδT细胞纯度大于80％时，即可收获γδT细胞；

所述γδT细胞扩增培养基的制备方法：向无血清培养基中加入IL-2和IL-15，混匀即得；

(4)将步骤(3)得到的γδT细胞用γδT细胞扩增培养基将细胞密度调至3-10×10⁶个细胞/mL，然后加入CAR病毒和polybrene进行感染，并置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养；

(5)待步骤(4)中感染3-8h后，去除培养基以去除病毒，得到改造后的γδT细胞，加入γδT细胞扩增培养基继续培养，每2-3d补加γδT细胞扩增培养基使细胞密度维持在2-4×10⁶个细胞/mL，每天检测改造后的γδT细胞比例，当比例大于10％时，收集的细胞即为嵌合抗原受体γδT细胞。

2.如权利要求1所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述γδT细胞刺激培养基中，唑来膦酸浓度为1～50μM，IL-2浓度为200-1000IU/mL，IL-15浓度为5-50ng/mL。

3.如权利要求1所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述无血清培养基中加有5-10v％的自体血浆。

4.如权利要求1所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述γδT细胞扩增培养基中，IL-2浓度为200-1000IU/mL，IL-15浓度为5-50ng/mL。

5.如权利要求1所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述CAR病毒的MOI为10-20。

6.如权利要求1所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，polybrene的终浓度为2-10μg/mL。

7.如权利要求1至6任一项所述嵌合抗原受体γδT细胞的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，去除培养基的方法是采用离心，离心速率为200-300×g，时间为5-10min。