[发明专利]Cy系列荧光素的合成方法以及在DNA测序中的应用

说明书

本发明公开了一种Cy系列荧光素的合成方法以及在DNA测序中的应用，所述方法包括：A、将反应物与反应物YCH₂(CH₂)₄COOH或者YR回流，得到反应中间体和B、将步骤A所得与反应，生成然后直接加入一锅法生成目标产物；所述各结构式中，Y＝Cl，Br，I；R＝Me,乙基，丙基；X＝O，CH(CH₃)₂；R₁‑R₄任选H或者SO₃^‑、或者R₁,R₂与苯环共同构成萘环以及衍生物、或者R₃,R₄与苯环共同构成萘环以及衍生物；n＝1，3，5。该方法通过一锅法得到所需不对称结构荧光素，反应选择性好，容易分离纯化，且所需实验条件简单，合成过程均为常规化学反应，可用于大规模推广使用。

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种Cy系列荧光素的合成方法及其在DNA测序中的应用。

背景技术

荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。在众多的荧光染料中Cy类荧光素是一类被广泛应用的染料，这类染料具有大的摩尔消光系数、好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。荧光成像监测生物大分子在生命系统中最强大的技术之一，与在可见光区的吸收和发射的荧光传感器相比，近红外(NIR)范围内的染料在生命系统中的应用中是有利的生物成像试剂，由于近红外染料具有最小的光损伤，深部组织的渗透，和最小的背景的自发荧光。因此，发射红光和近红外区域的生色团近几年得到密切的关注。被广泛使用的NIR荧光团探针的菁染料，主要为Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7。

随着药物基因组学的发展，越来越多的药物可以依据个人的基因型来个体化的计算给药剂量，进而减小和避免药物毒副作用。而由于目前对于病人的基因型的检测价格昂贵且检测方法复杂，需要时间长，不适合广泛使用。荧光染料Cy销售价格昂贵，合成方法复杂，我们对这一系列化合物的合成方法进行了改进。关于这一系列荧光素的合成方法，已经有大量报道，但是这些已经报道的合成方法多为两步或多步反应，步骤繁琐，操作复杂，副反应多。在此，我们通过从Cy系列荧光素的传统合成方法入手，逐步分析每一步骤中的产率，反应平衡，分离纯化方法等，参考国内外相关研究，从溶剂的选择，反应条件等化学反应条件的改进，以及加料顺序等等方面进行了全面改进。通过对Cy系列荧光素的研究，并用NMR等对合成出的Cy3、Cy5及各中间体进行了表征。发现了其中间体的合成反应产物复杂，产率低，且不太稳定。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种Cy系列荧光素的合成方法及其在DNA测序中的应用。该合成方法采用一锅法合成了一系列不同发射波长及不同水溶性的Cy荧光素，反应原料简单、便宜，反应条件温和，操作简单，可适合大规模生产。

本发明通过将反应最后关键的两步反应改为一锅法，其中的关键中间体不必分离纯化，直接进行下一步反应，使得最终产物产率得到了很大提高，并降低了副产物的产生，同时使最终产物的分离纯化得到简化，从而降低了Cy系列荧光素的合成成本与使用成本。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种Cy系列荧光素的合成方法，包括以下步骤：

A、将反应物与反应物YCH₂(CH₂)₄COOH或者YR在有机溶剂中回流，得到反应中间体1，结构为和反应中间体2，结构为

B、将步骤A所得反应中间体1与反应，生成反应中间体a，结构为然后直接加入反应中间体2，一锅法生成目标产物；