[发明专利]一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法

说明书

本发明公开了一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，包括人工抗原制备、动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和亚克隆、25‑羟基维生素D3单克隆抗体纯化等步骤，由于25‑羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本发明将25‑羟基维生素D3偶联卵清白蛋白获得25‑羟基维生素D3人工抗原，所制备的25‑羟基维生素D3单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与25‑羟基维生素D3抗原结合力强等优点，可用于免疫荧光、酶联免疫或磁微粒免疫技术等来定性或定量检测人体中25‑羟基维生素D3表达水平，临床辅助预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法。

背景技术

血清25羟基维生素D3是合成25-OH-VD3的前体，是维生素D的主要循环形式，其半寿期较长,血中浓度较稳定，可直接反映机体维生素D的水平，维生素D参与不但钙磷代谢的调节作用，近年来维生素D被证实具有更为广泛的生物学效应和免疫学效应，包括用以预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症，抑制多种类型细胞的增殖，诱导细胞调亡和分化，调节机体免疫系统的功能等。因此，血清中的25羟维生素D3已经成为健康体检的重要指标。

现在有越来越多公司参与开发25羟维生素D3检测试剂盒，高品质的抗体，是开发25羟维生素D3检测试剂盒的关键技术和基础，但是当前的25羟维生素D3检测试剂盒，无论使用哪种技术，放射免疫法，胶体金，酶联免疫法，化学发光检测，磁微粒免疫技术，都不能得到与HPLC精确测试相媲美的结果，因此需进一步研发出一种25-羟基维生素D3单克隆抗体，可用于能够快速、准确检测25-羟基维生素D3的免疫检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，制备的抗体特异性好，亲和力高，能够用于25-羟基维生素D3免疫荧光检测试剂盒，对人体内25-羟基维生素D3蛋白做出准确的检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法，包括如下步骤：

(1)25-羟基维生素D3人工抗原制备：将25-羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25-羟基维生素D3蛋白；将OVA(卵清白蛋白)溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25-羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25-羟基维生素D3人工抗原；

(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将25-羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周进行抗原冲击，25-羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，取效价高小鼠的免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于培养液中；

(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；

(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，消毒后在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO₂培养箱中培养备用；