[发明专利]一种在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法

说明书

本发明公开了一种在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法，所述方法包含步骤：(a)将样本通过密度梯度离心处理样本，且样本取自癌症患者的体液，检测经处理样本，即候选样本，涉及生物检测技术领域。该在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法，利用两种能特异吸附的生物磁珠吸附出对端粒酶活性检测会产生影响的免疫细胞，使实验不会出现假阳性的结果，通过负向筛选保证其他细胞仍在样本中，使得实验不会出现假阴性的结果。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体为一种在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法。

背景技术

癌细胞是由正常细胞恶性转化产生，具有不可控的增殖和转移能力。由于癌细胞具有高转移特征，在癌症患者尿液、血液等体液中含有脱落的癌细胞，可以作为癌症早期筛查和预后诊断的指标。已知在超过90％的癌细胞中均可以检测到端粒酶，而正常体细胞中是检测不到端粒酶的。因此对新鲜体液样本中细胞的端粒酶的检测，可以对癌症的早筛及预后起到参考作用。这作为一种无创检查手段，在肿瘤的早期诊断中有着重要意义，随着分子生物学的发展、高敏感性方法的应用及特异性指标的检测，提高了微转移检测的阳性率，阳性者是否一定发展为转移，需要具备肿瘤细胞有活性和有癌细胞适宜种植的场所这两个基本条件。

患者的癌细胞表现出完全不同于正常细胞的生理特征。实际上，使用密度梯度离心的方法处理样本，获得的样本中除了所需的细胞，还含有大量其他的免疫细胞。在部分免疫细胞中有少量端粒酶的存在，会对端粒酶活性检测产生影响，从而出现假阳性等结果；使用流式细胞仪对样本进行处理的话，只能捕捉到已知表面抗原的癌细胞，对未知的不能捕捉，从而会产生假阴性等结果。

上述的检测癌症疾病的特性。为此，期望上述定制筛选癌细胞的方法有效地用于癌症相关疾病，因此已积极进行了以上研究。

本发明人做出了广泛的努力来开发更好的用于针对癌症的早期筛查与预后的方法，已开发出一个在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法，解决体液样本中部分免疫细胞对端粒酶活性检测的干扰问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明提供了一种在液体活检中利用生物磁珠负向筛选癌细胞的方法，所述方法包含步骤：(a)将样本通过密度梯度离心处理样本，且样本取自癌症患者的体液，检测经处理样本，即候选样本；(b)取得候选样本加入500ul的分离缓冲液，再加入经预洗的磁珠，并放置在四维旋转仪上进行旋转孵育，旋转过后再将候选样本放置在磁力架上，取上清转入新离心管中，通过离心设备，离心参数为1500rpm/min，水平离心5min，去掉上清液，得到标准样本；(c)将标准样本通过磁珠PCR技术去除残留的蛋白质影响，最后进行TRAP法对标准样本进行端粒酶活性检测，本发明还提供一种密度梯度离心方法；(i)将癌症患者的体液样本通过离心设备，离心参数为1500rpm/min，进行水平离心5min；(ii)将步骤(i)中离心后，所得样本去上清，并且加入5ml的1*PBS溶液，再加入2至3ml的淋巴细胞分离液，通过离心设备，离心参数为1600rpm/min，水平离心10min；(iii)将步骤(ii)中离心后，取所得样本的中间液面分界层液体3至4ml移至另离心管中，通过离心设备，离心参数为1500rpm/min，水平离心5min，去掉上清液，得到候选样本。

优选的，所述离心设备为GT10-1型离心机。

本发明还提供了一种分离缓冲液配置，其中步骤(b)中所述的分离缓冲液通过用1*PBS溶液配置，且包含0.1％BSA和2mM EDTA。

优选的，所述磁珠的型号包括thermofisher 11153D和thermofisher 11137D。