[发明专利]一种蛹虫草子实体及其固体培养基的液相分离分析方法

说明书

本发明提供的一种蛹虫草子实体及其固体培养基的液相分离分析方法主要包括以下步骤：（1）蛹虫草子实体及其固体培养基供试溶液的制备；（2）液相分离：采用5μm或10μm XCharge C18填料装填的250mm×4.6mm高效液相色谱柱，使用含0.1‑0.5%三氟醋酸和0‑2%甲醇的高比例水相作为起始洗脱溶剂进行梯度洗脱，检测波长为200‑400nm，流速0.1‑5ml/min，柱温10‑60℃，进样量0.1‑100μL。本发明的有益效果在于：采用极性修饰的反相固定相，以高比例水相起步进行等度或梯度洗脱，使其中腺苷和虫草素以外的极性化合物也都能够得到有效的保留和分离。

技术领域

本发明涉及分析化学领域，特别涉及一种蛹虫草子实体及其固体培养基的液相分离分析方法。

背景技术

蛹虫草（Cordyceps militaris L. Link），又名北虫草、北冬虫夏草，属子囊菌亚门、核菌纲、球壳目、麦角菌科、虫草属真菌。蛹虫草作为虫草属真菌的模式种，其宿主主要为鳞翅目的蚕蛾科、舟蛾科、天蚕蛾科等，它是由子实体与菌核（及虫或蛹的尸体部分）两部分组成的复合体。经研究表明，蛹虫草具有抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗衰老、调节免疫功能等药理活性，是具有营养、保健和医疗功效的宝贵生物资源，并在2009年被卫生部列为新资源食品（现名新食品原料）。

不同于野生的冬虫夏草，蛹虫草可在人工培养基上培养产生子实体，例如液体发酵和以大米为机制的固体培养方式等，因此其获得方式更适合工业化的大量生产，且不会对自然资源和植被产生破坏。目前，虫草素、腺苷等核苷类成分，仍被作为评价蛹虫草质量的主要参考指标，如申请号201310424244.8的专利提出了一种HPLC法分析蛹虫草子实体和其固体培养残基中腺苷和虫草素含量的方法。

但除此之外，蛹虫草作为一种发酵产物，其中还含有多种可能具有生物活性的小分子化合物。这些成分与虫草素和腺苷结构较相似，但极性更大，使用传统的反相色谱柱往往保留弱，得不到有效的分离，成为对蛹虫草类产品的深度功能挖掘和质量控制方法研究的瓶颈。如专利CN103308624B提出的冬虫夏草、蛹虫草的HPLC方法，虽然试图用指纹图谱的方法更全面的反应冬虫夏草和蛹虫草的成分，但也只定义了5个特征峰，且在0-5分钟显然有很多成分因为色谱保留不够而没有得到有效分离。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明主要针对蛹虫草子实体及其固体培养基中的成分极性普遍较大，保留较弱，开发了一种新的分离分析方法，以实现对蛹虫草提取物较全面的分离分析，从而为蛹虫草及其制品的物质基础和质量控制研究提供新的解决方案。

本发明提供的一种蛹虫草子实体及其固体培养基的液相分离分析方法主要包括以下步骤：

（1）蛹虫草子实体及其固体培养基供试溶液的制备：

将蛹虫草子实体及其固体培养基冷冻干燥，经粉碎机粉碎，精确称量蛹虫草子实体冻干粉末，加入去离子水、酸水或浓度为0-100%醇溶剂进行提取，提取结束后过滤得到澄清滤液，即为蛹虫草子实体及其固体培养基供试溶液；

进一步地，所述的醇溶剂为甲醇、乙醇、正丁醇或其混合物；

进一步地，所述的提取方法可以为加热回流或超声提取等常用的样品提取方式，所用溶剂比为1-30倍量；

（2）液相分离：

优选采用5μm或10μm XCharge C18填料装填的250mm×4.6mm高效液相色谱柱，使用含0.1-0.5%三氟醋酸和0-2%甲醇的高比例水相作为起始洗脱溶剂进行梯度洗脱，检测波长为200-400nm，流速0.1-5ml/min，柱温1-60℃，进样量0.1-100 μL。

本发明的有益效果在于：采用极性修饰的反相固定相，以高比例水相起步进行等度或梯度洗脱，使其中腺苷和虫草素以外的极性化合物也都能够得到有效的保留和分离。