[发明专利]一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法

说明书

本发明一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法，其中特异性引物包括β‑GRS基因扩增引物和探针、NAG基因扩增引物和探针、HOXA13基因扩增引物和探针、UBE2C基因扩增引物和探针；β‑GRS基因扩增引物序列如SEQ ID NO：1‑2所示，β‑GRS基因探针如SEQ ID NO：3所示；NAG基因扩增引物序列如SEQ ID NO：4‑5所示，NAG基因探针如SEQ ID NO：6所示；HOXA13基因扩增引物序列如SEQ ID NO：7‑8所示，HOXA13基因探针如SEQ ID NO：9所示；UBE2C基因扩增引物序列如SEQ ID NO：10‑11所示，UBE2C基因探针如SEQ ID NO：12所示。应用上述引物和探针制备的试剂盒具有检测速度快、敏感性高及特异性好等优点；同时该方法不依赖膀胱镜检查，直接针对标记物进行荧光定量检测，操作简单，因此适合在临床检验工作中普及应用。

技术领域

本发明属于核酸体外扩增检测领域，具体涉及一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法。

背景技术

膀胱癌是全世界五种最常见的恶性肿瘤之一。2010年仅在美国的膀胱癌病例预计为67,160例，预计死亡13,750例(A.Jemal等,Cancer Statistics,2010CA:A CancerJournal for Clinicians 60,277-300,2010)。当早期检查到时，5年内的存活率大约为94％，因此及时的介入可以显著提高患者存活的概率。目前，超过80％的膀胱肿瘤是非浸润性的乳头瘤(pTa或pT1)，但是剩余部分在诊断期间展现出肌肉浸润并具有更不太有利的预后。尽管肌肉浸润性疾病需要根治性手术，非肌肉浸润性肿瘤在有或没有膀胱灌注疗法的情况下，通过经尿道切除肿瘤可以更保守地治疗；然而，70％以上的患有早期阶段疾病的患者会在诊断后的前两年复发，这使得膀胱癌成为最常见的癌症之一。如果不及时治疗，这些最初非浸润性病变可演变为肌肉浸润性病变(F.Millan-Rodriguez等,J.Urol.164,680-84,2000)。膀胱癌的复发现象意味着患者需要至少每年一次的严格监控。为了生命的质量和积极的临床结果，及时发现疾病复发和初步诊断同样重要。

目前，用于膀胱癌检测的最可靠的方法为膀胱镜检查联合以受损部位的活组织切片检查。但是，该技术费时、为浸润性且其敏感性仅为约90％，这意味着约10％的癌症患者不能用这些方法得以检测。浅表性方法中的尿细胞学方法，可通过显微镜检测片状脱落的恶性细胞，为目前的优选方法。尽管细胞学方法的特异性约为95％，但其对低度损伤的敏感性很低，非常依赖样本质量且受到观测者间的高度差异的影响。

现有技术中已尝试对膀胱活组织标本中的遗传标记物进行检测。最常用的方法为微阵列分析，方法中将含有与推断的遗传标记的部分互补的寡核苷酸的阵列，与获自患者样本的mRNA或cDNA样本进行接触。用这些方法，一些近期的报告已鉴定出多种推测的膀胱癌标记物。但是，阵列技术相对而言为非定量性且变异较大。

对可指示膀胱癌存在的血液或尿液标记物进行荧光定量检测提供了用于改进该疾病检测的一种潜在方法。特异癌标记物也可提供用于监控疾病进程并保证所监控的外科、放疗和化疗治疗的功效的方法。如经过肝脏解毒与葡萄糖醛酸结合，失活的致癌物质可受尿中β-GRS裂解还原，使致癌活动部分重新释放，引发膀胱癌，因此，尿液中β-GRS升高标志有发生膀胱癌的趋向；NAG活性与膀胱肿瘤的病理分级有一定的关系，膀胱肿瘤分级越高，生长越快，其外周部分血供越差，越容易坏死，故尿中NAG也相应较高；HOXA13、UBE2C可在膀胱肿瘤组织和其它肿瘤组织中高度或持续地累积，对尿液中HOXA13、UBE2C进行检测和定量可提高膀胱癌检测的敏感性和特异性。但是，现有技术中对膀胱癌而言，依然存在着可用的标记物敏感性和特异性不足、荧光定量检测引物特异性差、定量检测灵敏度低等问题。

发明内容

针对现有技术中的技术空白，本发明的目的是提供一种检测膀胱癌的特异性引物和试剂盒及其检测方法，该方法无需依赖昂贵、繁琐且通常患者不易接受的膀胱镜检查，直接针对尿液或组织标记物进行荧光定量检测，检测灵敏度高、特异性强。