[发明专利]T2DM绝经后女性WNT3A基因多态性与骨代谢关系的研究及其应用

权利要求书

1.一种T2DM绝经后女性WNT3A基因多态性与骨代谢关系的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、生化指标的测定：测定并记录入选对象的体重指数(BMI)＝体重(kg)/身高(m)²、腰臀比、血压的临床指标；采用罗氏全自动生化分析仪测定：FPG、TC、TG、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血Ca、血P、ALP的生化指标；高压液相色谱法测定糖化血红蛋白；双能X线吸收法测定骨密度；

步骤2、基因的提取：(1)采取所有入选对象外周静脉血5ml，EDTA抗凝；(2)先在缓冲液GD及漂洗液PW中加入无水乙醇；①抽吸血液样本100ul，加入缓冲液GS100ul，再加入细胞裂解液500ul，颠倒混匀1000rpm离心1分钟，吸取上清，留下细胞核沉淀；②加入20ulPoteinase K溶液混匀溶解蛋白；③加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀后放置56摄氏度温水中10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液变清亮为止；④加入200ul无水乙醇沉淀DNA，充分颠倒混匀，此时出现絮状沉淀；⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑦向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑧再重复步骤⑦一次；⑨12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温10-15分钟以彻底晾干吸附柱材料中残余的漂洗液；⑩将吸附柱CB3转入离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加5-200ul洗脱液TB，室温放置5分钟，12000rpm，离心2分钟，将溶液收集到新的离心管中标号待用，保存于-80℃冰箱；

步骤3、基因多态性的测定：将提取的DNA使用Sequenom飞行时间质谱法测定Wnt3a基因位点rs752107及rs708114的多态性；

步骤4、应用SPSS17.0统计软件分析处理数据，计算出rs752107及rs708114位点的基因型频率及等位基因频率；应用卡方检验分析四组中各位点基因型分布是否符合哈迪温伯格平衡计量资料以均数±标准差表示，四组间计量资料用方差分析比较，组间计量资料如果基线资料不齐同采用协方差分析；计数资料用率表示，组间计数资料比较采用卡方检验，运用Logistic回归分析基因型与2型糖尿病及骨质疏松的发病风险，以OR值及95％可信区间表示；P<0.05为差异有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的T2DM绝经后女性WNT3A基因多态性与骨代谢关系的研究方法，其特征在于，步骤3具体为：

①使用Sequenom公司的引物设计软件为上述两个位点设计引物,并给生物公司合成；②多重PCR技术每个反应体系体积为5ul包含Water 1.8ul，10乘PCR Buffer 0.5ul，20mMMgCl₂0.5ul，25mM MgCl₂ 0.4ul，20mM dNTP Mix 0.1ul，0.5uM primer Mix 1ul，5u/ul PCREnzyme0.2ul,DNA样本0.5ul；94摄氏度4分钟，94摄氏度20秒，56摄氏度30秒，72摄氏度1分钟，总共45个循环，最后72摄氏度反应3分钟；③去除游离的dNTPs，总反应体系为7ul，包含Water1.53ul，10乘SAP Buffer 0.17ul，SAP Enzyme0.3ul，PCR产物5ul，37摄氏度40分钟，85摄氏度5分钟；④单碱基延伸总反应体系9ul包含Water0.619ul，10乘iPlex buffer plus0.2ul，iPlex terminator 0.2ul，Primer Mix 0.94ul，iPlex Enzyme 0.041ul，PCR产物7ul；94摄氏度30秒，94摄氏度5秒，52摄氏度5秒，80摄氏度5秒，总共40个循环，最后72摄氏度180秒；⑤将Clean resin树脂平铺到6mg的树脂版中，向延伸产物中加入16ul Water，将晾干的树脂倒入延伸产物板中后封模，旋转30分钟；⑥开启点样仪，将树脂纯化后的延伸物加置384孔的芯片上，运用飞行质谱法分析，检测结果用Sequenom软件分型出结果并记录基因型。

3.权利要求1所述T2DM绝经后女性WNT3A基因多态性与骨代谢关系的研究方法在糖尿病诊断试剂制备过程中的应用。